Mécanismes moléculaires contrôlant la biosynthèse de mycotoxines par le champignon micromycète Fusarium graminearum, Molecular mechanisms controlling mycotoxins biosynthesis by the micromycete fungus Fusarium graminearum

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Sous la direction de Christian Barreau
Thèse soutenue le 10 décembre 2010: Bordeaux 1
Fusarium graminearum est un champignon filamenteux qui parasite les plantes céréalières et le maïs et provoque la fusariose de l’épi. Durant l’infection, ce champignon produit des mycotoxines de la famille des trichothécènes qui s’accumulent dans les grains. Les processus de décontamination existants ne permettent pas d’éliminer complètement les trichothécènes. Ainsi, le meilleur moyen pour éviter leur accumulation dans les grains serait de pouvoir limiter leur occurrence au champ en contrôlant leur biosynthèse. Bien que la voie de biosynthèse des trichothécènes et les gènes Tri qui y sont impliqués soient bien décrits, les connaissances de base sur les mécanismes de régulation de ces gènes restent trop restreintes.Dans la première partie de ce travail, l’effet du pH sur la régulation des gènes Tri et la production de trichothécène a été étudié. En premier lieu, nous avons démontré que, in vitro, un pH acide joue le rôle d’inducteur alors qu’un pH neutre ou alcalin bloque l’expression des gènes Tri et la production de trichothécène. Ensuite, FgPac1, l’homologue du gène pacC/RIM101 codant le facteur de régulation par le pH chez les champignons a été identifié dans le génome de F. graminearum. A l’aide de souches recombinantes, nous avons démontré que la forme mature de ce facteur réprime l’expression des gènes Tri à pH acide et réduit la virulence du champignon lors de l’infection d’épis de blé. Enfin, le transcriptome de F. graminearum en réponse au pH et le rôle de Pac1 dans cette réponse a été analysé.Dans la deuxième partie de ce travail, le gène velvet sensible à la lumière, a été identifié chez F. graminearum. Ce gène constitue la composante clef d’un complexe qui coordonne la perception de la lumière avec le développement mais aussi avec le métabolisme secondaire chez les champignons. L’inactivation de FgVe1 chez F. graminearum nous a permis de démontrer son rôle dans le développement et la production de spores. Elle a montré aussi que ce gène est nécessaire pour permettre l’expression des gènes Tri, la production de trichothécène et la pathogénicité in planta.L’ensemble de ce travail permet de mieux comprendre la régulation de la production de trichothécène chez F. graminearum et ouvre des perspectives qui permettront sans doute, à long terme, d’élaborer des stratégies de lutte contre l’accumulation de trichothécène au champ.
-Fusarium graminearum
-Trichothécène
-Gènes Tri
-Régulation
-FgPac1
-FgVe1
The filamentous fungus Fusarium graminearum infects cereals plants and corn and causes “Fusarium Head Blight”. During infection, it produces mycotoxins belonging to trichothecenes family which accumulate in the grains. The available decontamination processes do not fully eliminate the trichothecene. Hence, the best way to avoid their occurrence in the grains is to limit their accumulation in the field by controlling their biosynthesis. Although the Tri genes implicated in the trichothecene biosynthetic pathway are well described, the basic knowledge regarding their regulation is still too limited.In the first part of this work, the effect of the pH on Tri genes regulation and trichothecene production was studied. First, we demonstrated that, in vitro, acidic pH acts as an inducer while a neutral or alkaline pH blocks Tri genes expression and trichothecene production. Then, FgPac1, the homologue of the pacC/RIM101 gene encoding the fungal pH regulatory factor was identified. Using recombinant strains, we demonstrated that the mature form of this factor represses Tri gene expression at acidic pH and reduces virulence during infection of wheat spikes. Finally, we analyzed the transcriptome of F. graminearum in response to pH and investigated the role of Pac1 in this response.In the second part of this work, the light-responsive velvet gene was identified in F. graminearum. This gene is the key component of a complex coordinating light perception with development and secondary metabolism in fungi. The disruption of FgVe1 in F. graminearum demonstrated its role in development and spores production. It also showed that this gene is necessary for Tri gene expression, trichothecene production and pathogenicity in planta.Overall, this work allows a better understanding of trichothecene regulation in F. graminearum and provides novel perspectives to develop new strategies against trichothecene accumulation during cereal growing in the field.
-Fusarium graminearum
-Trichothecene
-Tri genes
-Regulation
-FgPac1
-FgVe1
Source: http://www.theses.fr/2010BOR14198/document

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Langue Français
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THESE

Présentée à

L’UNIVERSITE BORDEAUX 1
Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé

Par

Jawad MERHEJ

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR

Discipline: Microbiologie


Mécanismes moléculaires contrôlant la biosynthèse de mycotoxines
par le champignon micromycète Fusarium graminearum



Soutenue le 10 décembre 2010, après avis de:

M. BRUEL Christophe Professeur Rapporteur
(Université Lyon 1)

M. LANGIN Thierry Directeur de Recherche
(INRA – Clermont Ferrand)


Devant la commision d’examen formée de:

M. BARREAU Christian Chargé de Recherche CNRS Directeur de thèse
M. COTTIN Patrick Professeur Bordeaux 1 Examinateur
M. NOEL Thierry Professeur Bordeaux 2
M. PUEL Olivier Ingénieur de Recherche INRA
Mon travail de thèse a été effectué au sein de l’Equipe des Mycotoxines, de l’Unité
MycSA (Mycologie et Sécurité Alimentaire), à l’Institut National de la Recherche
Agronomique (INRA) de Bordeaux. Ce travail a été réalisé dans le cadre d’une bourse
INRA - Région Aquitaine.

J’adresse mes remerciements les plus sincères à Christian BARREAU pour m’avoir
accordé sa confiance et pour avoir guidé cette recherche. Son accompagnement, ses conseils
avisés et sa disponibilité ont été précieux.

Je marque particulièrement ma profonde reconnaissance envers Florence FORGET pour
m’avoir accueilli au sein de son équipe. Ses encouragements et son soutien ont toujours été
présents au cours de ces années.

Je tiens à exprimer ma profonde gratitude à Kim-Hammond-Kosack , Directrice
adjointe de « Department of Plant Pathology and Microbiology – Rothamsted Research
Institute – UK », pour m’avoir donner l’opportunité de réaliser une partie de ce travail au
sein de son laboratoire. Je remercie sincèrement Martin Urban, chercheur à Rothamsted
Research Institute, pour ses conseils et sa disponibilité tout au long de mon séjour en
Angleterre.

Je remercie vivement Sonja Vorwerk , chercheur à « Febit GMBH – Allemagne », pour
la réalisation des expériences de « Microarrays ». Sa contribution s’est avérée déterminante
pour compléter ce travail.

Tous mes respects aux membres du jury, tout particulièrement Mr. Thierry LANGIN,
Directeur de recherche à l’INRA de clermont-Ferrand et Mr. Christophe BRUEL,
Professeur à l’université Lyon 1, qui m’ont fait l’honneur d’accepter d’évaluer mon travail
de thèse. J’espère être à la hauteur de leurs espérances.

Je remercie de tout coeur Vessela et Laetitia pour la sympathie qu’elles m’ont témoignées
durant mon séjour a MycSA. Leurs conseils scientifiques et techniques m’ont été
indispensables.

Un grand merci à Françoise, Marie-Noëlle, Christine et Gisèle pour leur aide dans les
différentes tâches quotidiennes. Merci également à l’ensemble du personnel de MycSA qui
m’a permis d’effectuer cette thèse dans de très bonnes et très agréables conditions de travail.

Tous mes remerciements vont également à Sébastien, Adeline, Denis, Carlos ainsi que
tous les stagiaires de MycSA, spécialement Sylvain, Laetitia et Ludovic qui ont contribué à
ce travail, pour leur amitié, leur bonne humeur et leur soutien qui m’ont permis de
travailler dans une ambiance des plus agréables. Publications Scientifiques


Articles en cours préparation

1- Merhej J, Richard-Forget F and Barreau C. Regulation of trichothecene production in
Fusarium: Recent advances and new insights Applied Microbiology and Biotechnology
(Revue bibliographique soumise pour publication).

2- Merhej J, Vorwerk S, Richard-Forget F, Barreau C. Genome-wide transcriptional
response to ambient pH and Pac1 regulatory factor in Fusarium graminearum.
(Article rédigé).

3- Merhej J, Saint-Felix L, Urban M, Richard-Forget F, Barreau C The velvet gene,
FgVe1, affects development and positively regulates trichothecene biosynthesis and
pathogenicity in Fusarium graminearum. (Article rédigé).

Article accepté

4- Merhej J, Richard-Forget F, Barreau C. The pH regulatory factor Pac1 regulates Tri
gene expression and trichothecene production in Fusarium graminearum. Fungal
Genetics and Biology. 2010. (accepté pour publication).

Article publié

5- Merhej J, Boutigny AL, Pinson-Gadais L, Richard-Forget F, Barreau C. Acidic pH as a
determinant of Tri gene expression and trichothecenes B biosynthesis in Fusarium
graminearum. 2010. Food Additives Contaminnants. 27(5):710-7.
Communications Scientifiques


Communication orale

1- Merhej J, Boutigny AL, Pinson-Gadais L, Forget-Richard F, Barreau C. Biosynthesis of
trichothecenes B in Fusarium graminearum is controlled by the Pac1 pH regulatory
factor. International Society of Mycotoxicology Conference. Tulln-Autriche, 9-11 Sept
2009.

Présentation poster

2- Merhej J, Vorwerk S, Cheng Y, Forget-Richard F, Barreau C. Analyse du transcriptome
des souches de Fusarium graminearum mutantes dans Pac1, le gène régulateur de
l’homéostasie du pH. Journée des Microbiologistes de l’INRA 2010. Futuroscope, 5 – 7
mai 2010.

3- Merhej J, Vorwerk S, Cheng Y, Forget-Richard F, Barreau C. Transcriptional analysis
of the response to extracellular pH changes in Fusarium graminearum Pac1 mutants
thand effect on trichothecenes B accumulation. Présentation poster. 10 European
Conference on Fungal Genetics. Leeuwenhorst - Pays-Bas, 29 mars - 1 avril 2010.

4- Merhej J, Forget-Richard F, Barreau C. Mécanismes de régulation de la production de
trichothécènes B chez Fusarium graminearum : Pac1, un nouveau régulateur
moléculaire pH-dépendant. Journées Jean Chevaugeon 2010. Aussois - France, 25 – 29
Janvier 2010.
Abréviations


ADN Acide désoxyribonucléique
ADNc ADN complémentaire
ADON Acétyldéoxynivalenol
ACN Acétonitrile
ARN Acide ribonucléique
CMC Carboxymethyl cellulose
DAD Diode Array Detector
DJ-PCR Double joint – Polymerase chain reaction
DON Déoxynivalenol
EC European Commission
ECD Electron Capture Detector
ESI Electrospray ionisation
FPP Farnésyl pyrophosphate
FX Fusarenone X
GFP Green Fluorescent Protein
GYEP Glucose Yeast Extract Peptone
HGT Horizontal gene transfer
HPLC High Performance Liquid Chromatography
NIV Nivalenol
PCR Polymerase Chain Reaction
PDA Potato Dextrose Agar
ppb Parties par billion
ppm Parties par million
rpm Rotation minute
RT Reverse Transcription
Taq Thermophillus aquaticus
TCT Trichothécène
TCT B Trichothécène de type B