ANNEXE (Projet de thèse afssa 2010)

Mcoulpier

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• Publié par: Zodaj
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Extrait

TITRE :Physiopathologie des infections à virus de Borna(BDV): étude de l’impact du BDV sur la neurogenèse humaine.

Directeur de thèse : Dr S. Zientara, directeur de l’UMR 1161 tel : [phone], fax: [phone],szientara@vetalfort.fr, Codirecteur de thèse : Dr M. Coulpier, CR1 INRA tel : [phone], fax : [phone],mcoulpier@vetalfort.fr Laboratoire : UMR 1161 INRA, AFSSA, ENVA de Virologie, Ecole Nationale Vétérinaire d'Alfort 7 Av du Gal de Gaulle 94704 MaisonsAlfort Sujet proposé pour une allocation fléchée de l’ED 425:OUI NON REFERENCES DE L’EQUIPE SUR LE SUJET: 1 Galabru J, Saron MF, Berg M, Berg AL, Herzog S, Labie J, Zientara S. 2000. Borna disease virus antibodies in French horses. Vet Rec. Dec 147:7212. 2 Dauphin, G., Legay, V., Sailleau, C., Smondack, S., Hammoumi, S., Zientara, S. 2001. Evidence of Borna disease virus genome detection in French domestic animals and in foxes (Vulpes vulpes). J Gen Virol. 82:21992204. 3 Dauphin G, Legay V, Pitel PH, Zientara S. 2002. Borna disease: current knowledge and virus detection in France. Vet Res. 33:12738. 4 Agier C., Gruest N., Eloit M., Coulpier M.  Development of a realtime RTPCR assay for detection of Borna disease virus : application to the search for Borna virus in asymptomatic horses. (article en préparation) 5 Agier C., Brnic D., Nicolas C., Montéro C., Milhavet O., Eloit M., Coulpier M  Human Neural Stem cell and their neuronal and glial cell derivatives are fully permissive for Borna virus. (article en préparation). COMPETENCES REQUISES PAR LE CANDIDAT : Le candidat, titulaire d’un master en Biologie, devra montrer un intérêt fort pour le domaine de la neurovirologie et des interactions viruscellules. Des compétences en techniques de base de culture cellulaire, biochimie et biologie moléculaire constitueront un plus. mais ne sont pas des conditions indispensables, puisque toutes les compétences requises pourront être acquises au sein de l’équipe d’accueil.

Physiopathologie des infections à virus de Borna(BDV) : étude de l’impact du BDV sur la neurogenèse humaine. CONTEXTE : Le virus de Borna (BDV) est un virus capable d’infecter un grand nombre de vertébrés. Il est responsable d’une infection persistante du système nerveux central (SNC) à l’origine de troubles du comportements. Les mécanismes cellulaireset moléculaires à l’origine de cessont mal troubles compris mais comme le virus est non cytolytique, les symptômes observés pourraient être la conséquence de perturbations de la physiologie des cellules neurales. L’utilisation de cultures primairesde neurones et d’astrocytes de rongeurs a en effet révélée des altérations cellulaires induites par la présence du virus. Ilpeut notamment perturber la transmission synaptique(Gonzalez Dunia et al., 2005)et la reprise du glutamate par les astrocytes (Billaud et al., 2000).  Lacapacité du BDVà infecter une grande variété d’espèces animales est un élément en faveur de l’existence d’un risque zoonotique. De fait, un lien entre une infection au BDV et les maladies mentales chez l’homme a été suggéré, d’abord sur la base d’une similarité des symptômes (troubles comportementaux), puis de la mise en évidenced’anticorps antiBDV et d’ARN viraux chez des patients psychiatriques ainsi que suite à l’isolement d’une souche virale chez un de ces patients (Nakamura et al., 2000). Les études épidémiologiques successives n’ont cependant pas permis de démontrer clairement ce lien (Chalmers et al., 2005) et rien n’est actuellement connu quant à la capacité de ce virus à altérer le fonctionnement des cellules du SNC humain.  Afinde déterminer si le virus peut en effet altérer la physiologie des cellules neurales humaines, nous avons développé des cultures primaires de neurones, astrocytes et cellules souches neurales humaines issues d’embryons humains. Nous avons montré pour la première fois que des cellules neurales primaires sont hautement permissives au BDV et quel’infection des cellules souches neurales induit de profondes altérations du processus de neurogenèse. Ces résultats montrent pour la première fois que le BDV est en mesure de perturber une étape clef de la neurogenèse et proposent un nouveau mécanisme par lequel il peut affecter le fonctionnement du SNC humain. OBJECTIFS :  Letravail de thèse proposé a pour but de caractériser les mécanismes par lesquels le BDV peut endommager le fonctionnement du SNC humainet d’identifier les mécanismes moléculaires mis en jeu. DEMARCHES EXPERIMENTALES :  Nostravaux actuels démontrent que le BDV altère fortement le processus de différenciation des cellules souches neurales humaines en neurones et astrocytes. Au cours de cette thèse, nous nous attacheronsd’abordà mieux caractériser le rôle du BDV sur cette étape clef de la neurogenèse ; nous chercherons notamment à élucider les voies de signalisation cellulaires perturbées par le virus et les protéines virales impliquées. Puis, nous tenterons de mieux comprendre le rôle du virus sur les 2 autres étapes clefs de la neurogenèse, la prolifération et la migration.  I.Impact du BDV sur la différenciation des cellules souches neurales humaines. I.1. Caractérisation Nous avons montré que l’infection par le BDV des cellulessouches neurales humaines réduit leur capacité à fournir de nouveaux neurones. Nous chercherons maintenant à déterminer si la diminution du nombre de neurones observéeprovient d’une incapacité à former de nouveaux neurones ou del’induction de la mort deneurones nouvellement formés. Une étude cinétique couplée à des techniques d’immunofluorescence et de quantification des protéines et des ARN cellulaires permettra de différencier entre ces 2 possibilités. Le type de mort neuronale induite (apoptose, nécrose, autophagie) et le type de neurones affectés seront caractérisésau moyen d’anticorps, de marqueurs et d’inhibiteurs spécifiques. I.2. Voies de signalisation cellulaires perturbées par le BDV Afin d’élucider les voies de signalisation cellulaires endommagées, deux approches sont envisagées.  Notrepremière approche sera basée sur les données de la littérature. Une étude récente de protéomique a révélé que le BDV est en mesure de perturber de nombreuses protéines de liaisonau

cytosquelette (Suberbielle et al., 2008). Hors, ces protéines jouent un rôle majeur dans les processus qui s’accompagnent de profonds remaniements morphologiques tels que la différenciation des cellules souches neurales en neurones et astrocytes. La protéine Gap 43, notamment, est bien décrite pour son rôle dans la différenciation neuronale et astrocytaire. Elle est aussi altérée par la présence du BDV dans des modèlesin vitroetin vivo. Nous chercherons à mettre en évidence leur rôle dans nos cultures et à déterminer si des modulations par le BDV de leur transcription, traduction, phosphorylation et localisation peuvent rendre compte des altérations observées.  Enparallèle, une approche plus systémique de protéomique sera débutée par un autre membrede l’équipe d’accueil (M Cochet, AI INRA) à travers une collaboration avec une plateforme de protéomique (PAPPSOINRA Jouy en Josas). La comparaison des profils protéomiques de cellules non infectées et de cellules infectées en cours de différenciation fournira de nouvellespistes d’étude dont certaines pourront être explorées au cours de cette thèse. I.3. Protéines virales impliquées  Afinde déterminer quelles sont les protéines virales impliquées dans les altérations observées, nous construirons des vecteurs lentiviraux recombinantspermettant soit d’exprimer les protéines virales d’intérêt(la nucléocapside et la phosphoprotéine) soit de les sousréguler (shRNA) dans les cellules souches neurales.L’étudiant recevra l’aide d’un membre de l’équipe pour la construction d’une partiedes vecteurs. Par ailleurs, une collaboration sera initiéeavec l’équipe du Dr Schwemmle (Dpt de Neuroanatomie, Freiburg, Allemagne) qui dispose des outils de la génétique inverse. Des virus mutés de façon spécifique pourront être obtenus fournissant une autre approche permettant de révéler le rôle des protéines virales.  II.Impact du BDV sur la prolifération et la migration des cellules souches neurales humaines.  Proliférationet migration constituent deux autres étapes importantes de la neurogenèse. L’impact sur la prolifération sera quantifié par détection de l’activité d’une enzyme mitochondriale (wst1, Roche) lors des phases aigues et chroniques (persistance) de l’infection et lacapacité des cellules a garder intact leur pouvoir migratoire sera évaluée selon la méthode décrite dansDurbec et al., 2008. De la même façon que décrit précédemment, lorsque des modifications seront observées, les voies de signalisation endommagées par la présence du virus seront recherchées (ex: détournement des voies induites par le couple EGF/bFGF lors de la prolifération). Les outils développés au paragraphe précédent seront utilisés pour identifier les protéines virales impliquées.

CONCLUSION :

L’impact des maladies mentales sur notre société est dramatique tant d’un point de vue économique que d’un point de vue humain.En plus des facteurs génétiques et environnementaux, les virus, parmi lesquels le virus de Borna, sont suspectés de contribuer à leur développement.Le travail de cette thèse fournira des clefs permettant de mieux comprendre la pathogenèse des maladies comportementales liées à une infection virale persistante chez l’homme. REFERENCES : 1 Chalmers,R.M., D.R.Thomas, and R.L.Salmon. 2005. Borna disease virus and the evidence for human pathogenicity: asystematic review. QJM 98:255274. 2 GonzalezDunia,D., R.Volmer, D.Mayer, and M.Schwemmle. 2005. Borna disease virus interference with neuronalplasticity. Virus Res 111:224234. 3Nakamura,Y., H.Takahashi, Y.Shoya, T.Nakaya, M.Watanabe, K.Tomonaga, K.Iwahashi, K.Ameno, N.Momiyama,H.Taniyama, T.Sata, T.Kurata, J.C.de la Torre, and K.Ikuta. 2000. Isolation of Borna disease virus from human brain tissue. J Virol 74:46014611. 4 Reif A, Schmitt A, Fritzen S, Lesch KP. 2007. Neurogenesis and schizophrenia: dividing neurons in a divided mind?Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 257:290299. 5Suberbielle E, Stella A, Pont F, Monnet C, Mouton E, Lamouroux L, Monsarrat B, GonzalezDunia D. 2008 Proteomicanalysis reveals selective impediment of neuronal remodeling upon Borna disease virus infection. J Virol. 82:1226512279.

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