Comparaison de sols résistants ou non à la maladie du piétin-échaudage du blé par une approche puces

H.Sanguin

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Les Actes du BRG, 6 (2006) 197-209© BRG, 2006Article originalComparaison de sols résistant ou non à lamaladie du piétin-échaudage du blé par uneapproche puce à ADN taxonomique 16S ciblantles bactéries rhizosphériques phytoprotectricesdu genre(1) (2) (1)Hervé SANGUIN , Kévin GAZENGEL , Lionel KRONEISEN ,(1) (1)Claire PRIGENT-COMBARET , Geneviève GRUNDMANN ,(2) (1)*Alain SARNIGUET , Yvan MOËNNE-LOCCOZ(1)UMR CNRS 5557 Écologie Microbienne, IFR 41 Bio-Environnement et Santé,Université Lyon 1, 43 bd du 11 Novembre 1918, 69622 Villeurbanne Cedex, France(2)UMR INRA Biologie des Organismes et des Populations Appliquée à la Protec-tion des Plantes, Domaine de la Motte, BP 35327,35653 Le Rheu Cedex, FranceAbstract: Comparison of soils suppressive or not to take-all disease of wheatby 16S taxonomic microarray targeting plant-protecting rhizospherebacteria. Take-all is an important wheat disease caused by the soil-bornefungus Gaeumannomyces graminis var. tritici. Disease severity can be high, but a declineof take-all disease may take place in the following years in case of wheat monocrop-ping. Microbial populations known to be associated to take-all decline (diseasesuppressiveness) include culturable antagonistic fluorescent Pseudomonas spp. pro-ducing the antifungal compound 2,4-diacetylphloroglucinol. The objective of thisstudy was to assess changes in the diversity of rhizosphere pseudomonads linkedwith take-all decline of wheat, following a ...

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LesActesduBRG,6(2006)197-209 ©BRG,2006 Articleoriginal Comparaisondesolsrésistantounonàla maladiedupiétin-échaudagedubléparune approchepuceàADNtaxonomique16Sciblant lesbactériesrhizosphériquesphytoprotectrices dugenre HervéS ANGUIN (1) ,KévinG AZENGEL (2) ,LionelK RONEISEN (1) , (1)(1) ClaireP RIGENT -C OMBARET ,GenevièveG RUNDMANN , AlainS ARNIGUET (2) ,YvanM OËNNE -L OCCOZ (1)* (1)UMRCNRS5557ÉcologieMicrobienne,IFR41Bio-EnvironnementetSanté, UniversitéLyon1,43bddu11Novembre1918,69622VilleurbanneCedex,France (2) UMRINRABiologiedesOrganismesetdesPopulationsAppliquéeàlaProtec- tiondesPlantes,DomainedelaMotte,BP35327, 35653LeRheuCedex,France Abstract:Comparisonofsoilssuppressiveornottotake-alldiseaseofwheat by16Staxonomicmicroarraytargetingplant-protectingrhizosphere bacteria.Take-allisanimportantwheatdiseasecausedbythesoil-borne fungusGaeumannomycesgraminisvar.tritici.Diseaseseveritycanbehigh,butadecline oftake-alldiseasemaytakeplaceinthefollowingyearsincaseofwheatmonocrop- ping.Microbialpopulationsknowntobeassociatedtotake-alldecline(disease suppressiveness)includeculturableantagonisticfluorescentPseudomonasspp.pro- ducingtheantifungalcompound2,4-diacetylphloroglucinol.Theobjectiveofthis studywastoassesschangesinthediversityofrhizospherepseudomonadslinked withtake-alldeclineofwheat,followingaculture-independentapproachbasedon theuseofa16SrRNA-basedtaxonomicmicroarray.Themicroarraycontainsabout 700probes,whichtargetbacteriaatvarioustaxonomiclevels.Certainprobes(about 70)targetpseudomonads,includinggroupsofbiocontrolPseudomonasstrains(about 20probes).Thelatterweredefinedinthisworkafterphylogeneticanalysisof16S rRNAsequencesavailableindatabasesforbiocontrolstrainsandotherpseudomo- nads,basedonNeighborJoining(withKimura2parameter)andMaximumParci- monymethods.ThemicroarrayprobesweredefinedusingARBsoftware (http://www.arb-home.de)andtheywerecheckedinsilico.Mosthaveamelting temperatureof65±5°C,GC>50%,nosecondarystructureorasecondarystruc- turewitha-2kcalmol-1andmeltingtemperature<50°C,andtheydonot formstablehomoduplex.Theprobeswerespottedby5’C6-NH 2 covalentlinkon slides.Eachbasicpatternfortheprobesetisreplicatedthreetimesperslide. RhizospheresampleswerecollectedattheINRAstationofLaGruche(Brittany, * Correspondanceettirésàpart:[e-mail] 791

H.Sanguinetal. France)fromplotsgrownwithwheatforoneyear(treatmentPI;lowleveloftake- alldisease),fiveyears(treatmentPV;highlevelofdisease)ortenyears(treatment PX;lowlevelofdisease,suppressivenessreached).Thisexperimentalset-upen- abledcomparisonoftreatmentsundersameconditionsofsoilcomposition,micro- climate,wheatcultivarandfarmingtechniques.RhizosphereDNAwasextracted andsubjectedtoPCRusingprimingconditionsdesignedinthisworktotarget biocontrolpseudomonads.ClusteranalysisofmicroarraydataobtainedafterPCR ofPseudomonaspopulationsinthewheatrhizospherediscriminatedmainlybetween treatmentsPIandPX,treatmentPVbeinginanintermediateposition.Theresults areinaccordancewithquantitativePCRdataobtainedforthetotalpseudomonads. Overall,treatmentPXappearstobeassociatedwithaparticularcompositionin biocontrolpseudomonads(whichcomprisebiocontrolstrainsproducing2,4- diacetylphloroglucinol).Thesefindingsindicatethatthe16Staxonomicmicroarray isapromisingtoolforanalysisofbacterialdiversityassociatedwithdisease- suppressivesoils. bacterialcommunity/rhizosphere/soildiseasesuppressiveness/16Staxo- nomicmicroarray/quantitativePCR Résumé:Lepiétin-échaudagedubléestunemaladiecauséeparlechampignon Gaeumannomycesgraminisvar.tritici.Lamonoculturepeutentraînerunerésistancedusol àlamaladie,etcertainsPseudomonasspp.fluorescentssontimpliqués.CesPseudomonas rhizosphériquesontétéétudiésparuneapprochedetypepuceàADNtaxonomique ciblantl’ADNr16S.Lapucecontientenviron700sondes;70correspondentaux Pseudomonas,etparmiellesunevingtainecibledesgroupesdesouchesphytoprotectri- ces.LeséchantillonsproviennentdeLaGruche,oùlebléestcultivédepuis1an(peu desymptômesdepiétin-échaudage),5ans(symptômesélevés)ou10ans(symptômes limités;résistanceàlamaladie).UneamplificationPCRdesPseudomonasspp.fluores- centsrhizosphériquesaétéréalisée.L’analysemultivariéedesrésultatsdistingueles traitements1anet10ans,letraitement5ansprésentantunesituationintermédiaire. LesrésultatssontenaccordaveclesdonnéesdePCRquantitativesurlesPseudomonas totaux.Letraitement10ansestassociéàdesgroupesparticuliersdesouchesphyto- protectricesquiproduisentdu2,4-diacétylphloroglucinol.Cetteétudeamontré l’intérêtdel’approchepuceàADNpourétudierladiversitédesPseudomonasassociésà larésistancedusolaupiétin-échaudagedublé. communautébactérienne/rhizosphère/résistancedusolauxmaladies/ puceàADNtaxonomique16S/PCRquantitative 1.INTRODUCTION Lepiétin-échaudagedubléestunemaladiecauséeparlechampignontel- luriquephytopathogèneGaeumannomycesgraminisvar.tritici[22].Lorsd’une monoculturedeblé,cettemaladiedevientprogressivementplusimportante etpeutalorscauserdesdégâtsimportants.Néanmoins,dansdenombreux 189

DiversitédesPseudomonasassociésàlarésistancedusolauxmaladies,étudiéeparpuceàADN cas,unphénomènederésistancedusolàlamaladie(appelédéclin)semet progressivementenplacelesannéessuivantes,permettantd’atteindreun étatderésistancedusolàlamaladie[21],[28]. PlusieursétudesontmisenévidencelerôleimportantdesPseudomonasspp. fluorescentsproducteursducomposéantifongique2,4-diacétylphloroglucinol danscedéclindupiétin-échaudage[4],[15],[27].Ils’agitdebactériesdontles capacitésphytoprotectricesontétémisesenévidencedansplusieurstypesde pathosystèmesdifférents[7],[14].LespopulationscultivablesdePseudomonas spp.fluorescentsproducteursde2,4-diacétylphloroglucinolontétécaractéri- séesauniveaudeplusieurssolsrésistants[14],ycomprisdanslecasdela résistanceaupiétin-échaudagedublé[4],[27].Néanmoins,laplupartdesré- sultatsdisponiblesjusqu’icidécouledel’analysedepopulationsbactériennes cultivables. Denombreusesméthodesmoléculairesexistentpouranalyserladiversité despopulationsbactériennes.Lamajoritéd’entreelles(DGGE,etc.)corres- pondàdesméthodesd’empreintegénétique,quinepermettentpasuneiden- tificationaiséedestaxonsimpliqués.Plusrécemment,desapprochesdetype puceàADNtaxonomiqueontétéproposéespourpalliercettelimitation. Ellessontgénéralementfondéessurlegènerrs[13],[18],quicodel’ARN ribosomique16S.CetteapprochepuceàADNtaxonomiqueadéjàétésuivie pourl’analysedelacompositiondelacommunautébactériennerhizosphéri- que[18],[20]. L’objectifdeceprojetétaitd’analyser,àl’aided’unepuceàADNtaxonomi- queciblantl’ADNr16S,labiodiversitédesPseudomonasfluorescentsrhizosphé- riquesenrelationavecledéclindupiétin-échaudagedublé.Leprototypede puceàADNtaxonomiquedeSanguinetal.[20]aétécomplétéavecdessondes ciblantdesPseudomonas,ycomprisdesPseudomonasphytoprotecteurs.Ensuite, l’outilpuceàADNetlaPCRquantitativeontétéutiliséspourcomparerdes solsrésistantsounonaupiétin-échaudagedublé. 2.MATÉRIELETMÉTHODES 2.1.Analysedesphytoprotecteurs Lesséquencesd’ARNr16SdePseudomonasphytoprotecteursdisponibles danslesbasesdedonnéesontalignéesavecCLUSTALX[25],etdesanaly- sesphylogénétiquesontétéréaliséesavecMEGAversion3.0[10].Lesmé- thodesutiliséesétaientleNeighborJoining(NJ)[19],avecleparamètreKimura 2(K2P),etlemaximumdeparcimonie(MP)[2]. 991

H.Sanguinetal. 2.2.Dessindessondes LessondesontétéconçuesenutilisantlelogicielARB[11] (http://www.arb-home.de),commedécrit[20].Laqualitédessondesaété évaluéeinsilico(températuredefusionTm,énergielibre secondaires)avecOligo5(MolecularBiologyinsights,WestCascade,CO).La plupartdessondesretenuesontunTmde65±5°C,unGC>50%,pasde structuresecondaire(oustructuresecondaireavec-2kcalmol -1 et Tm<50°C)etneformentpasd’homoduplexstable. 2.3.Préparationdeslames LessondesontétésynthétiséesparEurogentec(Seraing,Belgique)avec ungroupeC6-NH 2 en5’pourliaisoncovalente[6]surlamealdéhydeAL (SchottNexterionAG,Mainz,Allemagne).Letraitementdessondes,leur fixationsurlame,lesconditionsdeconservationdeslames,etlestraitements deslamesavanthybridationsontdécritsparSanguinetal.[20]. L’agencementdebasecomprenddeuxcopiesdestémoinsEUB338et EUB342(témoinspositifsetbornespourl’analysed’image)etunecopiede chacunedesautressondes.Cetagencementdebaseestrépététroisfoispar .emal 2.4.Échantillonsdesolrhizosphériqueetextractiond’ADN LedispositifexpérimentalINRAdeLaGruche(àPacé,IlleetVilaine)est unchamp(luvisol)subdiviséenplusieursparcellesayantsubidescyclesdiffé- rentsdeculturedeblé.LesinfestationsparG.graminisvar.triticisontnaturelles (pasd’apportd’inoculum).Pour2004,lestraitementsétaientlessuivants: PI=1annéedeculturedeblé(peudesymptômesdemaladie),PV=5an- néesdeculturedeblé(symptômesimportants),etPX=10annéesdeculture deblé(peudesymptômesdemaladie;étatderésistancedusol). Unéchantillonnageaétéeffectuédans3parcellespourchaquetraite- ment,avec2plantespourchaqueparcelle.Pourlesplantesprélevées,le niveaud’attaquedusystèmeracinaireparG.graminisvar.triticiétaitde14 (16)%pourPI,69(21)%pourPV,et24(24)%pourPX,cesvaleurs étantreprésentativesdecellespourl’ensembledesparcelles[Lebretonetal., nonpublié].Lesolrhizosphérique(adhérentauxracines)aétérecueillipour chaqueplante[3],donnantdeséchantillonsde0,5gdesol.L’extraction d’ADNdeséchantillonsderhizosphèreaétéeffectuéecommedécritpar Griffithetal.[5]. 002

DiversitédesPseudomonasassociésàlarésistancedusolauxmaladies,étudiéeparpuceàADN 2.5.AmplificationPCRdeetmarquagepourl’hybridation Pourrrs,lesdeuxamorcessensétaientPseuBC2-10rc(5’- GAGCGGTAGAGAGGTGCTTG-3’)etPseu5rc(5’-AGCACGGGTACT TGTACCTG-3’),combinéesà16SPSER[23].Cesdeuxcombinaisons d’amorcesdonnentdesampliconsde1,4kb.Ellespermettentd’amplifierrrs àpartirdetouslesPseudomonasphytoprotecteurstestésetce,avecunebonne spécificité.Eneffet,desamplificationshorsdesPseudomonasphytoprotec- teursontseulementétéobservéesdanslecasdeP.syringae(nonpublié),une espècephytopathogènequin’estpasdocumentéecommepouvantcoloniser larhizosphèredemanièresignificative.Lesamorcessenscomprenaientun sitepromoteurT7(5’-TAATACGACTCACTATAG-3’)en5’,cequiper- metensuiteunetranscriptioninvitrogrâceàlapolyméraseARNT7. LemélangePCR(50µl)contenaitdutamponderéaction1,0,25µMde chaqueamorcesens(PseuBC2-10rcetPseu5rc)et0,5µMdel’amorce 16SPSER,1,5mMMgCl 2 ,50µMdechaquedNTP,15ngd’ADN,0,025mg ml -1 deT4Gene32(RocheAppliedScience,Meylan)et1,25UdeTaqEx- pandHighFidelity(RocheAppliedScience).LaPCRcomprenaitunedénatu- rationà94°Cpour3min,35cyclesavec45sdedénaturationà94°C,45s d’appariementà61°C,90sd’élongationà72°C,etuneélongationfinalede7 minà72°C.LesproduitsPCRontétépurifiéssurcolonnePCRQIAquick (QIAGEN).LaconcentrationenADNaétédeterminéeparDOà260nm. Lemarquagedesamplicons16SparCy3-UTP(AmershamBiosciences EuropeGmbH,Saclay)aétéréalisépartranscriptioninvitro,commedécrit .]42[ 2.6.Hybridation,lecture,ettraitementdesdonnéespuceàADN Lesconditionsd’hybridationsontcellesdeSanguinetal.[20],àpartirde 400ngd’ARNmarqué.Deuxlamesontétéutiliséesparéchantillon.Les lamesontétébalayéesà532nm(pourCy3)àl’aided’unscannerGeneTac LSIV(GenomicSolutions,Huntingdon,GB).Lesimagesontétéanalysées [20]aveclelogicielGENEPIX4.01(Axon,UnionCity,CA). LetraitementdesdonnéesaétéeffectuéenutilisantR(http://www.r- project.org),commedécrit[20].Laracinecarréedesvaleursd’intensité(mé- dianedusignalmoinsbruitdefond)aétéexpriméeentermedepourcen- tagedel’intensitétotaledetouteslessondesdel’agencementdebase.Une sondeaétéconsidéréepositivequandi)savaleurexcédaitcelledestémoins négatifsplus2écart-typesetii)aumoins2des3copiesdonnaientunrésul- tatpositif.Laclassificationhiérarchique(clustering)desdonnées d’hybridationaétéréaliséesousR(Ward/distanceEuclidienne). 102

H.Sanguinetal. 2.7.PCRquantitative LeséchantillonsderhizosphèreétudiésparpuceàADNontégalement étéanalysésparPCRquantitativepourestimerlespopulationsdePseudomo- nasspp.totaux.Laquantitéd’amplicongénéréeaveclesamorcespA/ Pseu1r(233pb)aétémesuréesurABIPrism770HT(AppliedBiosystem) aveclemélangeréactionnelsuivant:10,5µleau,12,5µlMastermixTaq- SybrGreen2(KitQuickGoldStar,Eurogentec),0,5µldechaqueamorce (à12,5µM)et1µldel’ADNextraitde0,5gdesolrhizosphérique.LaPCR quantitativeestconduiteavecuncyclede3minà95°Cet40cyclesà2 étapesde15sà95°Cet1minà60°C.Lapuretéduproduitamplifiéest vérifiéeparleprogrammededissociationsuivant:15sà95°C,20sà 60°C,unemontéeprogressivependant19min59sjusqu’à95°C,puis15s à95°C.LaquantificationestréaliséeenréférenceàunePCRquantitative aveclesamorcespA/Pseu1rsur1µld’unegammeétalonde1,4ngà0,007 ngdel’amplifiatobtenuparPCRaveclesamorcespA/pH’surADNex- traitdesolrhizosphérique. 3.RÉSULTATS 3.1.Phylogéniedesphytoprotecteurs NosrésultatsindiquentquelesPseudomonasphytoprotecteursdontlasé- quencerrsestconnueappartiennentàtroisgroupesphylogénétiquesmajeurs (tabl.I),àsavoirlescomplexesd’espècesdénotés«P.fluorescens»et«P.chloro- raphis»parAnzaietal.,[1],ainsiquelegroupeARDRA1définiparKeeletal. [9]surlabasedesrésultatsd’amplified16SribosomalDNArestrictionanalysis (ARDRA),confirmantlesrésultatspubliéssurd’autrescollectionsdesouches [16],[17].Septgroupesdesouchesphytoprotectrices(BC-AtoBC-G)ontété distinguésdanscetravail(tabl.I),quellequesoitlaméthodephylogénétique utilisée.Lamajoritédessouchesantagonistesisoléesdubléàpartirdesol résistantaupiétin-échaudageappartientaugroupeBC-G. 202

DiversitédesPseudomonasassociésàlarésistancedusolauxmaladies,étudiéeparpuceàADN TableauI:GroupesdePseudomonasdéfinisdanscetteétudesurlabasedecritères phylogénétiquesetdistributiondanscesgroupesdesouchesphytoprotectricesdela littérature. Planted’originepourdessouchesphytoprotectrices emblématiques GroupesdesouchesInformationAutres phytoprotectricestaxonomique Blé monocots Dicots BC-A Groupe PF CHA0,Pf1,Pf-5, ARDRA1PGNR1 Complexe«P.IAM12353, BC-B chlororaphis»DSM6698T BC-C Complexe«P. K94.23 K94.08,SBW25, fluorescens»Ki353 Complexe«P. BC-D fluorescens» PCL1171DR54 Complexe«P. BC-E fluorescens» F113,ATCC29736T Complexe«P. BC-F fluorescens» PITR2PILH1,SBK26 KD,Pf29A, K92.46,CM1’A2, BC-G Complexe«P.Q65c80,Q2- 3-1 TM1A3,NFM421, fluorescens»87,Q37-87, K94.31 P97.30 3.2.Sondespourphytoprotecteurs ParmilessondesconçuespourdesPseudomonas,12apparaissentcomme présentantunintérêtparticulierpourl’étudedePseudomonasphytoprotec- teurs(tabl.II).Surlabasedesanalysesinsilico,4d’entreelles(Pseu4à Pseu7)permettentl’étudedessouchesdugroupeBC-A.Les8autressondes sontPseuChlo(pourdessouchesBC-B),PseuBC4-3(pourdessouchesBC- C,BC-FetBC-G),Pseu20,Pseu22,PseuBC2-10,PseuBC2BC3et PseuBC2BC3-2(pourdessouchesBC-DàBC-G),etPseu28(pourdes souchesBC-E).Aucunesondesatisfaisanten’apuêtreconçuepourBC-C oupourunedistinctionefficaceentreBC-D,BC-FetBC-G.L’analysepar clusteringdesrésultatsd’hybridationexpérimentaleobtenusavecunedou- zainedesouchesdePseudomonasmontrequelessouchespeuventainsiêtre distinguéeslesunesdesautres(nonmontré). 302

H.Sanguinetal. TableauII:SondesclésciblantdesPseudomonas. SondeSpécificité aSéquence5’3’ GAM-mrc2 b Gammaproteobacteria T G T T A TC G A G A C T C C TGCCGCCAGC- Pseu1Pseudomonasspp.TAATCCGACCTAGGCTCATC PseuD b Pseudomonasspp. ACCTAGGCTCATCTGATAGC- GCAAGG Pseu4GroupeBC-AetP.syringaeCACCAGGTACAAGTACCCGT Pseu5GroupeBC-AetP.syringaeCAGGTACAAGTACCCGTGCT Pseu6GroupeBC-AetP.syringaeACCAGGTACAAGTACCCGTG Pseu7GroupeBC-AetP.syringaeCCACCAGGTACAAGTACCCG PseuChloP.chlororaphis(BC-B)GGTAAGTACCCTTCCTCCCA PseuBC4-3QuelquessouchesdeBC-C,BC-FetBC-GCCCACTCATGAATCACACCG Pseu20 PlupartdessouchesdeBC-D,BC-E,BC-Fet CGCTCTCAAGAGGTGCAAGC BC-G,unesouchedeBC-BetP.lini Pseu22 P B l C up - a G r , t u d n e e s s s o o u u c c h h e es d d e e B B C C - - B D et , P B . C li - n E i ,BC-Fet CTCTCAAGAGGTGCAAGCAC Pseu28GroupeBC-EGTAACGTCAAGACACCAACG PseuBC2-10 GroupeBC-D[saufP.corrugata],BC-E,BC-F, CAAGCACCTCTCTACCGCTC BC-G,unesouchedeBC-BetP.lini PseuBC2BC3 GroupeBC-D[saufP.corrugata],BC-E,BC-F, GTGCAAGCACCTCTCTACCG BC-G,unesouchedeBC-BetP.lini PseuBC2BC3-2 B G C ro - u G p , e un B e C s - o D uc [s h a e uf de P. B co C r - ru B ga e t t a P ], .l B in C i -E,BC-F, TGCAAGCACCTCTCTACCGC a Ciblethéoriquesurlabased’unappariementparfait. b GAM-mrc2estdérivéedeHiraishietal.8etPseuDaétéconçueparRudietal.18. 3.3.AnalysedessolsparpuceàADN LapuceàADNtaxonomiqueaétéutiliséepouranalyserlarésistancedes solsdelaGruche.LessondesneciblantpaslesPseudomonasn’ontpasdonné designald’hybridation,cequiétaitattendu.Lafigure1montrelesrésultats declusteringdesdonnéesd’hybridationdelapucepourlestraitementsPI(1 annéedeculturedeblé;peudesymptômesdemaladie),PV(5annéesde culturedeblé;symptômesimportants),etPX(10annéesdeculturedeblé; peudesymptômesdemaladie/étatderésistancedusol).Uneamplification PCRdesPseudomonasspp.fluorescentsaétéréalisée.L’analysedistingueles traitements1anet10ans.Pourletraitement5ans,l’échantillonV41est groupéavecceuxdutraitementPX,alorsqueleséchantillonsV21etV51 sontgroupésavecceuxdutraitementPI.LetraitementPX(10ans)estdonc associéàunecompositionparticulièredesPseudomonasdanslarhizosphère dublé. 402

DiversitédesPseudomonasassociésàlarésistancedusolauxmaladies,étudiéeparpuceàADN PXPX+PVPIPI+PV Figure1:Résultatsdeclusteringdesdonnéesd’hybridationdelapuceàADN taxonomiquedanslecasdesampliconsPCRPseudomonasobtenusdelarhizosphère dubléausitedeLaGruche.LestraitementsétudiéssontPI(1annéedeculturede blé;peudesymptômesdemaladie),PV(5annéesdeculturedeblé;symptômes importants),etPX(10annéesdeculturedeblé;peudesymptômesdemaladie/ étatderésistancedusol).LeséchantillonsPIsontnotés:I21,I41etI51;leséchan- tillonsPV:V21,V41etV51;etleséchantillonsPX:X21,X41etX51.Lessigles quisuiventlenomdeséchantillonsbiologiquescorrespondentauxrépétitionsmé- thodologiquesdel’hybridation. 3.4.Analysedesspp.parPCRquantitative LorsqueleséchantillonsderhizosphèreontétéétudiésparPCRquanti- tative,enutilisantdesamorcespourlesPseudomonasspp.totaux,lesrésultats ontdonnéenviron2,0(1,0)10 10 copiesg -1 solpourPIetpourPX,alors quelerésultatpourletraitementPV(phasedesensibilitéélevéeàlamala- die;6,0(3,2)10 10 copiesg -1 sol)étaitstatistiquementsupérieur(testde Newmann-KeulsàP<0,05). 4.DISCUSSION CommecetravailaconcernélespopulationsrhizosphériquesdePseudomo- nas,ungenredontl’organisationtaxonomiqueestactuellementmaldéfinie, septgroupesphylogénétiquesontétédéfinisiciàpartirdesouchesdePseudo- monasphytoprotectricesparmilesmieuxconnuesdanslalittérature[7],[9], [26].Cesgroupessesituentdanslescomplexes«P.fluorescens»(pourBC-Cà 025

H.Sanguinetal. BC-G)et«P.chlororaphis»(pourBC-B),oucorrespondentaugroupeARDRA 1encequiconcerneBC-A.Cedernierrassembledessouchesphytoprotectri- cesproduisantàlafoisdu2,4-diacétylphloroglucinoletdelapyolutéorine[9]. Lesseptgroupesconstituésicisontglobalementcompatiblesaveclessubdivi- sionsfaitessurlabasedei)l’ARDRA[9],ii)lesanalysesRAPD[9],iii)la RFLPsurphlD[26],etiv)lesétudesphylogénétiquessurhcnBC(synthèsede l’HCN)[16]ethrcN(systèmedesécrétiondetypeIII)[17].Lessouchesiso- léesdublédansuncontextededéclindupiétin-échaudagesontdansle groupeBC-G. L’identificationdeseptgroupesphylogénétiquespourlessouchesde Pseudomonasphytoprotectricesafacilitélesprocéduresdedessindesondes 16Spourlapucetaxonomique.Cependant,leniveaudepolymorphismede rrspourcesbactériesn’apaspermisd’obtenirdessondesspécifiquespour chacundesseptgroupes.Lesrésultatsd’hybridationsursouchespuresindi- quentquelapuceàADNpeutdiscriminerprincipalemententrei)BC-A,ii) BC-E,etiii)BC-B,BC-D,BC-FetBC-G. LesampliconsPseudomonasétudiésauniveaudeséchantillonsdeLaGru- cheontétéobtenusavecdeuxjeuxd’amorces,cartouteslessouchesphyto- protectricesnepouvaientêtreamplifiéesavecunseuljeud’amorce.LesPseu- domonasrhizosphériquesproducteursde2,4-diacétylphloroglucinolsontplus nombreuxdanslessolsrésistantsaupiétin-échaudagedublécomparésaux solsnonrésistants[15].Ici,lesrésultatsd’hybridationpourleséchantillons rhizosphériquesindiquentquelaplupartdessondespourlesPseudomonasphy- toprotecteursahybridé,quelquesoitl’échantillonconsidéré.Cecisuggèreque larhizosphèredubléestcoloniséesimultanémentpardifférentstypesdePseu- domonas,dontdessouchesphytoprotectrices.DesPseudomonasphytoprotec- teurssonteneffetaisésàobteniràpartirdublédansdessolsrésistants[27]. Néanmoins,letraitementPX(étatrésistant)estassociéàunecomposition particulièreensouchesdePseudomonasdanslarhizosphèredeblé. PourcequiestdesPseudomonastotaux,ilapparaîtquelesniveauxdepo- pulationétaientplusélevéspourletraitementPV(étatsensible),quel’on considèrelesdonnéesd’hybridationoucellesdePCRquantitative.Cesré- sultats,quis’expliquentparlefaitquelesnécrosesracinaireslibèrentdes substratsorganiquesstimulantlacroissancedesPseudomonas,sontune confirmationderésultatspubliés[12],[21],[22].Autotal,lesrésultatsde cetteétudepréliminairemontrentl’intérêtdel’approchepuceàADNtaxo- nomique16Spourcomparerdessolsrésistantsetnonrésistantsaupiétin- échaudagedublé,cetteapprochepermettantaussidecaractériserlesres- sourcesgénétiquesbactériennesassociéesàlarésistancedusolàlamaladie. 602

DiversitédesPseudomonasassociésàlarésistancedusolauxmaladies,étudiéeparpuceàADN REMERCIEMENTS LesanalysespuceàADNontétéeffectuéesenrelationaveclaplateforme techniqueDTAMB/GénopôleRhône-Alpes,auniveaudel’IFR41«Bio- EnvironnementetSanté»situéeàl’UniversitéLyon1.NousremercionsJ. B ERNILLON etC.O GER (DTAMB)pourleuraideauniveaudel’approche puceàADN,etL.L EBRETON ,P.L UCAS etS.C ARILLO (UMRBiologiedes OrganismesetdesPopulationsAppliquéeàlaProtectiondesPlantes,INRA LeRheu)pourlesuiviépidémiologiqueausitedeLaGruche. RÉFÉRENCES [1]AnzaiY.,KimH.,ParkJ.,WakabayashiH.,OyaizuH.,Phylogeneticaffiliation ofthepseudomonadsbasedon16SrRNAsequence,Int.J.Syst.Evol.Micro- biol.50(2000)1563-1589. [2]BerryV.,GascuelO.,Ontheinterpretationofbootstraptrees:Appropriate thresholdofcladeselectionandinducedgain,Mol.Biol.Evol.13(1996)999- .1101 [3]ChaponA.,BoutinM.,RiméD.,DelalandeL.,GuillermA.Y.,SarniguetA., DirectandspecificassessmentofcolonisationofwheatrhizoplanebyPseudomo- nasfluorescensPf29A,Eur.J.PlantPathol.109(2003)61-70. [4]deSouzaJ.T.,WellerD.M.,RaaijmakersJ.M.,Frequency,diversity,andactivity of2,4-diacetylphloroglucinol-producingfluorescentPseudomonasspp.inDutch take-alldeclinesoils,Phytopathology93(2003)54-63. [5]GriffithsR.I.,WhiteleyA.S.,O'DonnellA.G.,BaileyM.J.,Rapidmethodfor coextractionofDNAandRNAfromnaturalenvironmentsforanalysisofribo- somalDNA-andrRNA-basedmicrobialcommunitycomposition,Appl.Envi- ron.Microbiol.66(2000)5488-5491. [6]GuoZ.,GuilfoyleR.A.,ThielA.J.,WangR.,SmithL.M.,Directfluorescence analysisofgeneticpolymorphismsbyhybridizationwitholigonucleotidearrays onglasssupports,NucleicAcidsRes.22(1994)5456-5465. [7]HaasD.,DéfagoG.,Biologicalcontrolofsoil-bornepathogensbyfluorescent pseudomonads.Nat.Rev.Microbiol.3(2005)307-319. [8]HiraishiA.,IwasakiM.,ShinjoH.,Terminalrestrictionpatternanalysisof16S rRNAgenesforthecharacterizationofbacterialcommunitiesofactivated sludge,J.Biosci.Bioeng.90(2000)148-156. [9]KeelC.,WellerD.M.,NatschA.,DéfagoG.,CookR.J.,ThomashowL.S.,Con- servationofthe2,4-diacetylphloroglucinolbiosynthesislocusamongfluorescent Pseudomonasstrainsfromdiversegeographiclocations,Appl.Environ.Microbiol. 62(1996)552-563. [10]KumarS.,TamuraK.,JakobsenI.B.,NeiM.,MEGA2:molecularevolutionary geneticsanalysissoftware,Bioinformatics17(2001)1244-1245. [11]LudwigW.,StrunkO.,WestramR.,RichterL.,MeierH.,Yadhukumar,Buchner A.,LaiT.,SteppiS.,JobbG.,ForsterW.,BrettskeI.,GerberS.,GinhartA.W., GrossO.,GrumannS.,HermannS.,JostR.,KonigA.,LissT.,LubmannR., 702