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• Publié par: Mofeg
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Extrait

Mesure du FRET par FLIM ICIPN Plateforme d’Imagerie Cellulaire de l’IFRde Neurosciences

Durée de vie de fluorescence La durée de vie de fluorescence est le temps moyen qu’une molécule reste à l’état excité Le déclin de durée de vie de la E-GFP est mono-exponentiel, alors que celui de la CFP est un déclin bi-exponentiel NICIP Plateforme d’Imagerie Cellulaire de l’IFRde Neurosciences

NICIP Plateforme d’Imagerie Cellulaire de l’IFRde Neurosciences Bref rappel sur la fluorescence dans le cas de FRET La durée de vie de fluorescence est le temps moyen qu’une molécule reste à l’état excité ’S 1 S o S 1 KK rrn Donneur TERF K TERF Accepteur Longueur d’onde (nm)

Pourquoi la mesure de durée de vie de fluorescence permet de mesurer le FRET? rnK r Donneur Fluorescence Accepteur Fluorescence Donneur seul : τ donneur = 1/(Kr+Knr) Donneur + Accepteur
FRET τ donneur = 1/(Kr+Knr+ K FRET ) Δ t NICIP Plateforme d’Imagerie Cellulaire de l’IFRde Neurosciences

NICIP Mesure du FRET par FLIM: Plateforme d’Imagerie Cellulaire de l’IFRde Neurosciences Proportion des molécules en interaction Exemple: cas du donneur GFP avec durée de vie mono-exponentielle τ= temps moyen des durées de vie τ 1τ 2τ Δ t Δ t Δ t  Déclinmono-exponentiel=100%desmoléculesdu donneursontlibres
pasdeFRET  Déclinmono-exponentielavecduréedevie diminuée=100%desmoléculesdudonneursonten interaction
FRET  Déclinbi-exponentiel 1/3desmoléculesdudonneureninteraction
FRET 2/3desmoléculesdudonneurlibres
pasdeFRET

Lresa Mesure du FRET par FLIM FLIM= Fluorescence lifetime imaging microscopy 0=t Laser pulse Fluorochrome potS τ = moyenne des durées de vie tratS Mesure du ialéd NICIP Plateforme d’Imagerie Cellulaire de l’IFRde Neurosciences Comptage de photons unique corrélés en temps Délai Δ t

l P a u s l e s r e     Pulse 1 Pulse 2 Pulse 3 Pulse 4 . . . Pulse n Mesure du FRET par FLIM 76 Mhz un pulse toutes les 13 ns 4 Mhz un pulse toutes les 250 ns Photon émission NICIP Plateforme d’Imagerie Cellulaire de l’IFRde Neurosciences τ = moyenne des durées de vie Délai (canaux) Δ t (max 13 ns) A chaque pulse laser on récupère le Δ t d’un seul photon permettant de construire l’histogramme du déclin de fluorescence

NICIP Système d’acquisition pour le FLIM Plateforme d’Imagerie Cellulaire de l’IFRde Neurosciences photodiode Titane-Sapphire Laser Scanner signal 76 MHz (730-980 nm) with › 200 fs pulse (Coherent) Acquisition d’image Confocal Scanner (Leica SP2) 0001 001 01 1 1.0 Détecteurs du FLIM (SPC) PMT ayant une haute résolution temporelle Mesure du déclin de durée de vie de fluorescence

Exemple de mesure de FRET par FLIM PSD95-GFP Stargazin-mCherry PDZ1 PDZ2PDZ3 PSD95-GFP Stargazin-mCherrySuperposition C  o T n a t n r d ôl e e m  p  G os F i P ti - f mCherry NICIP Plateforme d’Imagerie Cellulaire de l’IFRde Neurosciences Echantillon  PSD95-GFP  Stargazin-GFP + Stargazin-mCherry  PSD95–GFP + Stargazin –mCherry  PSD95–CterGFP + Stargazin -mCherry

Exemple de mesure de FRET par FLIM 0001 001 01 1 1 P 0 S 0 D % 9   5 T - = G  2 F . P 066 ns PSD-95-GFP PSD-95-mCherry 100% T= 2.083 ns τ = temps moyen des durées de vie de fluorescence P S S ta D r - g 9 a 5 z - in G - F m P Cherry 6 3 3 6 . . 4 6 % %     T T1 2     = =     1 2 . . 0 0 9 5 9 1     n n s s NICIP Plateforme d’Imagerie Cellulaire de l’IFRde Neurosciences Δ t (ns) Tandem GFP-mCherry 30% T1 = 1.279 ns 70% T2 = 2.096 ns

NICIP de l’IFRde Neurosciences Efficacité de FRET et calcul de distance Plateforme d’Imagerie Cellulaire E = efficacité de FRET E = 1-( τ DA / τ D ) τ DA = durée de vie du donneur en présence de l’accepteur τ D = durée de vie du donneur en absence de l’accepteur R = distance entre le donneur et l’accepteur R = Ro x [(1/E)-1] 1/6