ETUDE DE LA DYNAMIQUE CELLULAIRE DE LA PROTEINE MDR1 PAR LA TECHNIQUE DE FRAP
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„„„„ETUDE DE LA DYNAMIQUE CELLULAIRE DE LA PROTEINE MDR1 PAR LA TECHNIQUE DE FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)Tuteur Tounsia Aït-Slimane-Maud Dachy, François Ten Ket Kian, Fanny MorlentDachy Ket „„„„„„„„PlanIntroduction1 Description de la protéine MDR1 (multidrug-resistance )2 Rôle et intérêt de la protéine MDR1 en physiopathologie3 Trafic intracellulaire de la protéine MDR1 4 MDR1 et les microdomaines lipidiqueslipidiquesObjectif du projetDémarche expérimentale1 Expression de la protéine de fusion MDR1-GFP dans les cellules hépatiques2 La technique de FRAPRésultats attendus„„„„„„„„„„„„„„Description de la protéine MDR1MDR1 est le produit d’un gène du chromosome 7 2 séquences homologues composées de 6 domaines transmembranairesAppartient à la famille des transporteurs ABCProtéine ubiquitaireFortement exprimée dans les cellules endothéliales et épithéliales (à la surface apicale) et à la surface cellulaire dans plusieurs tumeursResponsable de la résistance phénotypique de certains médicaments et de la résistance de certaines cellules cancéreuses à la chimiothérapieIntervient dans la translocation de certains glycosphingolipides(glucosylcéramide) ) „„„„„„Rôle et intérêt de MDR1 en physiopathologieLa protéine MDR1 assure le transport membranaire d'environ quarante médicaments (immunosuppresseurs, des hormones stéroïdiennes, des inhibiteurs calciques, ou encore des antiprotéases ) ...

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alPn„„„„Introduction1 Description de la protéine MDR1 (multidrug-resistance)2 Rôle et intérêt de la protéine MDR1 en physiopathologie3 Trafic intracellulaire de la protéine MDR1 4 MDR1 et les microdomaineslipidiquesObjectif du projetDémarche expérimentale1 hEéxpparteisqsuieosn de la protéine de fusion MDR1-GFP dans les cellules 2 La technique de FRAPRésultats attendus
„„„„„„„Description de la protéine MDR1MDR1 est le produit d’un gène du chromosome 7 2 séquences homologues composées de 6 domaines transmembranairesAppartient à la famille des transporteurs ABCProtéine ubiquitaireFortement exprimée dans les cellules endothéliales et épithéliales (à la surface apicale) et à la surface cellulaire dans plusieurs tumeursResponsable de la résistance phénotypique de certains médicaments et de la résistance de certaines cellules cancéreuses à la chimiothérapieIntervient dans la translocation de certains glycosphingolipides(glucosylcéramide)
„„„Rôle et intérêt de MDR1 en physiopathologieLa protéine MDR1 assure le transport membranaire d'environ quarante médicaments (immunosuppresseurs, des hormones stéroïdiennes, des inhibiteurs calciques, ou encore des antiprotéases)Responsable de la résistance phénotypique de certains médicaments, elle peut ainsi moduler leurs concentrations plasmatiques ou intracellulaires et influencer la réponse au traitement MDR1 intervient dans de nombreuses maladies: Sida, Tumeur épithéliale rénale (résistance à la chimiothérapie), Alzheimer, Maladie de Parkinson, Maladie inflammatoire intestinale
Trafic intracellulaire de la protéine MDR1 dans l’hépatocyte „Voie indirecte (la transcytose) : les protéines GPI et transmembranaires sont adressées d’abord vers la membrane basolatéralepuis redirigées au canalicule biliaire„Voie directe: les protéines à plusieurs domaines transmembranaires sont adressées directement du réseau trans-golgien vers le canalicule biliairePn-GPIMT-nPpesB1RDM1PRMCBBLJT
MDR1 et les microdomaineslipidiques (Rafts)„Microdomainesriches en glycosphingolipideset cholestérol „Ils permettent le transfert de protéines spécifiques vers la membrane„résistants à la solubilisation à froid par certains détergents (triton, lubrol, Brij…)„MDR1 est associée aux microdomainesinsolubles dans le Lubrol123456789011121niosullbMeicrodomainedeGSLGPI r(fat)1lohCSoluble (non-raft)23 typ4e LRu5aftTMbr6ol7WX89011121
Objectif du projetMieux comprendre l’interaction de la protéine MDR1 avec les microdomaineslipidiques en étudiant sa dynamique directement sur cellules vivantesMDR1-GFPTransfectionde MDR1-GFP dans les cellules hépatiquesPFG
.1.2.3La technique de FRAP (Fluorescence RecoveryAfterPhotobleaching)Extinction localisée (photoblanchiment) de la fluorescence Mesure de la réapparition de la fluorescence dans la zone éteinteCalcul du coefficient de diffusion et du % de la fraction mobile
losotyccytosolMicroscopie classique(1 photon)Microscopiebiphotonique1µ-2m   ésilacoltnemihcnalbotohp nu eriaf ed temrepeuqinotohpib eipocsorcim aL
étorp sed euqimanyd al reuqilpxe ruop sésoporp selèdoMProtéines fortement associéesToutes les protéines ont le même coefficient de diffusionProtéines fortement associées aux raftsFaible coefficient de diffusionDiffusion indépendantes des autres protéineserporp tnos ruel iuq noisuffid ed stneiciffeoc sed tnoeniamodorcim emêm nu snad seéroprocni seniétorPstfar xua seéicossa seni
Est-ce que la structure àplusieurs domaines transmembranaires de MDR1 détermine ses caractéristiques de diffusion latérale?Pour répondre àcette question nous allons comparer la mobilitéde protéines ayant des structures distinctes -Protéine àancre GPI utilisant la voie de transcytosepar les microdomainesinsolubles dans le triton-Protéine àun seul domaine transmembranaire associée aux microdomaineslipidiques-Protéine àplusieurs domaines transmembranaires
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