Etude pharmacologique de la voie de signalisation impliquée dans l 'apoptose des péricytes rétiniens

Sissi Houel Denis, Ulriche

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Extrait

TABLE DES MATIERES AVANTPROPOS ………………………………………………………………….. 17 ABREVIATIONS ………………………………………………………………….. 19 RESUME ……………………………………………………………………...……….. 21 ABSTRACT ……………………………………………………………………………22 INTRODUCTION …………………………………………………………………. 23 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ………………………………………………. 29 LA RETINOPATHIE DIABETIQUE …………………………………………….. 31 ILE DIABETE SUCRE ET SES COMPLICATIONS ……………………………………… 31 1Le diabète insulinodépendant (type I ou DID)………………… … ……….…. 31 2Le diabète sucré non insulinodépendant (type II ou DNID)…………………. 32 3Les complications chroniques du diabète sucré……………….…………….… 33 IILA PHYSIOPATHOLOGIE DE LA RETINOPATHIE DIABETIQUE ……………….…. 33 1Structure et fonction des microvaisseaux rétiniens………………………….… 34 2Altérations de la structure et de la fonction des microvaisseaux rétiniens……36 21Les phases cliniques de la rétinopathie diabétique…………………………. 36 22Les modifications structurales et fonctionnelles au cours de la rétinopathie diabétique………………………………………………………………………...38 221La membrane basale……………………………………………… 38 222Les péricytes………………………………… ……...……………… 38 223Les modifications morphofonctionnelles de la barière hémato rétinienne et de l’endothélium rétinien………..…………………….……39 III LA PATHOGENESE DE LA RETINOPATHIE DIABETIQUE ………………….….…. 41 1L’hypothèse hémodynamique……………………………………………….….. 41 2 Les hypothèses biochimiques……………………………………………….….. 42 21La voie des polyols………………………………………………………42 22L’activation de la protéine kinase C (PKC)…………………….…....…. 44

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23La voie des hexosamines……………………………………..………….45 24La glycosylation non enzymatique………………………………… …… 47 241La formation des produits avancés de glycation……………… 47 242Les produits avancés de glycation……………………………. 50 243Les conséquences pathologiques de la glycation……………... 51 2431La glycation de la matrice extracellulaire……………….51 2432La glycation des protéines circulantes et intracellulaires.52 2433L’interaction des AGE avec leurs récepteurs………..…. 52 244 AGE et rétinopathie……………………………………… …... 56 25Le stress oxydant………………………………………………………. 58 251Le stress oxydant dans le diabète: cause ou conséquence?…... 58 252La production de radicaux libres…………………………….. 59 253La modification des défenses antioxydantes…………...……... 60 254Le stress oxydant et la rétinopathie diabétique…..……….…... 61 L’APOPTOSE ……………………………………………………..………………….… 63 IINTRODUCTION ………………………………..………………………………………... 63 IILES CARACTERISTIQUES DE L’APOPTOSE …………………………………………. 64 1Les stigmates morphologiques………….………………………………………..64 2Les stigmates biochimiques…………….……………………………………….. 65 21L’externalisation de marqueurs membranaires……… … … … ….……… 66 22La fragmentation de l’ADN…………………………….………………..66 23L’atteinte mitochondriale……………………………….…… …… …….67 III LES MECANISMES MOLECULAIRES DE L’APOPTOSE …………………………… 68 1La phase d’induction: les signaux de mort..…………………………………….69 2DeC. elegansaux mammifères…………………………………………….….… 69 3Les caspases………………………………………………………………….…… 70 31La nomenclature et les différentes classifications des caspases……… .... 70 32Les descriptions structurales………………………………………….….72 34Les mécanismes d’activation des caspases………………………………73 341L’autoactivation des caspases initiatrices…………… ……...… 73 342La transactivation des caspases………………………………. 75 35Les mécanismes de contrôle de l’activation des caspases…………..…...76 351La régulation par phosphorylation………………………….... 76 352La régulation redox des caspases………………………….…. 77 354La localisation subcellulaire des caspases………………….... 78 355Les inhibiteurs de caspases………………………………….... 78

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36Les substrats protéolytiques des caspases………………………………. 79 37L’apoptose caspaseindépendante………………………………………. 80 4La famille de Bcl2……………………………………………………………..…81 41Le rôle des protéines de la famille de Bcl2…………………………….. 81 42La régulation de la fonction des membres de la famille de Bcl2….…… 83 5Le stress oxydant……………………………………………………….…….….. 84 51La formation des espèces radicalaires de l’oxygène (ROS) dans l’apoptose…………………………………………………………………….84 52La modification des défenses antioxydantes dans l’apoptose……….….. 86 6Les céramides……………………………………………………………...…….. 86 61Le métabolisme des sphingolipides…………………………………. .…. 86 62Les voies enzymatiques de formation des céramides dans l’apoptose…..88 63Les sites subcellulaires de la génération de céramides proapoptotiques .. 90 64 Les mécanismes de régulation des voies de synthèse des céramides dans l'apoptose : synthèsede novoet sphingomyélinases.….………………….….92 641La voie de biosynthèse de novo…………………………….…. 92 642La voie des sphingomyélinases…………….…… … ………….. 92 65Les cascades de signalisations activées par les céramides et leurs conséquences sur l’apoptose et la prolifération cellulaire……….……… …… 94 651Les céramides et la voie des cjunterminal kinases (JNK)…... 94 652Les céramides et la mitochondrie………………………….…..95 66La régulation des niveaux endogènes des céramides: l’équilibre survie/mort cellulaire…………………………………………………….….. 96 661La voie de la sphingosine1phosphate……………………….. 97 662La sphingomyéline synthase……………………………….….. 98 663La glucosylcéramide synthase…………………………….…... 99 MATERIEL ET METHODES ……………………………………..………. 101 MATERIEL ……………………………………………………………………….……..….103 IREACTIFS ………………………………………………………….……………………..103 IIAPPAREILS ………………………………………………………..…………….………104 METHODES ……………………………………………………………… … … … …. … …...104 IPREPARATIONS DES AGEMETHYLGLYOXAL (AGEMGX )…………….…...……. 104 1Préparation d'AGEMGX dépourvus en ions métalliques………..….…..…. 104 2Dosage de l'acide ascorbique………………………………………..…….…… 105

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IICULTURE CELLULAIRE ………………………………………………….…..……… 106 1Mise en culture primaire des péricytes rétiniens de bœuf……..…..………… 106 2Trypsination des péricytes rétiniens de bœuf………….…………...……….…107 3Culture des péricytes rétiniens en présence de glucose et d’AGE MGX………………………….………………………………………..…….…..…107 4Culture des péricytes rétiniens en présence de divers agents pharmacologiques………………………………………………………………… 108 IIIDETECTION ET QUANTIFICATION DE L'APOPTOSE DES PERICYTES RETINIENS …………………………………………………………………………………108 1Marquage à l’annexine V et à l’iodure de propidium……………….………….108 2Dosage ELISA des oligonucléosomes…………………………………………… 109 IVDOSAGE DES CERAMIDES ET DES DIACYLGLYCEROLS (DAG) DANS LES PERICYTES RETINIENS …………………………………………………………………. 111 1Extraction des lipides…………………………………………………….……… 111 2Phosphorylation par la DAGkinase…………………………………….……… 112 21 Réactifs et solutions…………………………………………………... 112 22 Réaction de phosphorylation………………………………………….. 113 3Quantification des produits phosphorylés………………………………….… 113 VDOSAGE DES PROTEINES PAR COLORATION AU NOIR AMIDE ……………....… 114 VIIMMUNODETECTION DES CASPASES ET DE RAGE SUR MEMBRANE DE NITROCELLULOSE (WESTERN BLOTTING )…………………………………………...114 1Préparation des échantillons……………………………………….………….. 114 2Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDSPAGE) et coloration au bleu de Coomassie……………………………………………. 115 3Electrotransfert des protéines sur membrane de nitrocellulose…….………. 116 4Immunodétection des protéines transférées………………………….………. 116 41Tampons utilisés………………………………………………….………. 116 42Révélation des protéines………………………………………….………. 116 43Spécificité de la reconnaissance antigénique……………………….…….. 117 44Standardisation des signaux par rapport à l'actine………….……….……. 118 VITRAITEMENT STATISTIQUE DES RESULTATS …………………………………… 118

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RESULTATS/DISCUSSION …………………………………………………. 119 CHAPITRE I EFFETS D'AGENTS IMPLIQUES DANS LE DIABETE (AGE ET GLUCOSE) SUR L’APOPTOSE DES PERICYTES RETINIENS ……...…….123 IEFFETS DES AGEMGX SUR LES PERICYTES RETINIENS ………………………… 123 1L'apoptose des péricytes……………………………………………………….. 123 2La production de DAG et de céramides dans les péricytes………………….. 126 IIEFFETS DU GLUCOSE SUR LES PERICYTES RETINIENS …………………………. 126 IIIIMMUNODETECTION DU RECEPTEUR AUX AGE, RAGE, SUR LES PERICYTES RETINIENS ………………………………………………………………………….……. 128 IVDISCUSSION ………………………………………………………………….……….. 129 CHAPITRE II IDENTIFICATION DES VOIES DE PRODUCTION DE CERAMIDES ET DE DAG INDUITES PAR LES AGEMGX DANS LES PERICYTES RETINIENS ………………………………………………………………………………………..……. 135 IVOIES DE PRODUCTION DES CERAMIDES ACTIVEES DANS LES PERICYTES …. 135 1Implication d'une céramide synthase (ou sphinganineacyltransférase) ?… 136 2Implication d’une sphingomyélinase acide?…………………………………...137 IIVOIE DE PRODUCTION DES DIACYLGLYCEROLS DANS LES PERICYTES : implication d’une phosphatidylcholinephospholipase C?…………………………………140 IIIDISCUSSION …………………………………………………………………………... 143 CHAPITRE III IMPLICATION DE CASPASES DANS L'APOPTOSE DES PERICYTES RETINIENS INDUITE PAR LES AGEMGX …………………………………… 147 IEFFETS D’INHIBITEURS PEPTIDIQUES DES CASPASES ………………………...…. 147 1Les inhibiteurs peptidiques……………………………………………….……. 148 2Effet des inhibiteurs peptidiques de caspases sur l'apoptose des péricytes induite par les AGEMGX…………………………………………………….…. 148  15

3Effet des inhibiteurs peptidiques de caspases sur la production des DAG et des céramides induite par les AGEMGX……………………………………….……150 IIIMMUNODETECTIONS DES CASPASES2, 8 et 10 DANS LES PERICYTESSOUMIS AUX AGEMGX …………………………………………………………………………… 152 1Immunodétection de la caspase8………………………………………………153 2Immunodétection de la caspase10……………………………………………. 154 3Immunodétection de la caspase2………………………………………………157 IIIDISCUSSION…………………………………………………………………………. 159 CHAPITRE IV INDUCTION D’UN STRESS OXYDANT DANS LES PERICYTES RETINIENS TRAITES PAR LES AGEMGX …………………………………… 167 ILES DIFFERENTES CLASSES D’ANTIOXYDANTS TESTES ………………………….167 IIEFFETS DE LA NACETYLLCYSTEINE (NAC )………………...……………...…… 168 IIIEFFETS DES AUTRESANTIOXYDANTS SUR L’APOPTOSE DES PERICYTES INDUITE PAR LES AGEMGX ………………………………………….…………………171 IVTRAITEMENT DES AGEMGX PAR DES CHELATEURS DE METAUX ET LEUR EFFET SUR L’APOPTOSE DES PERICYTES RETINIENS ……………………………… 172 VIMMUNODETECTION DE LA CASPASE10 DANS LES PERICYTES CULTIVES AVEC LES AGEMGX ET LA NAC (10 µM )………………………………………………..……. 175 VIDISCUSSION …………………………………………………………………..………. 177 CONCLUSIONS/PERSPECTIVES ……………………………………..… 183 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ……………………………….. 193 ANNEXES ……………………………………..………………………………………236

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