Melanin in the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatur: discovery of a novel melanin in the fungus and the use of conidial melanin as a target for camelid heavy-chain antibodies [Elektronische Ressource] / von Jeanette Christina Schmaler-Ripcke

Schmaler-Ripcke

Sujets

• Biologie

Informations

• Publié par: friedrich-schiller-universitat_jena
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 18
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 6 Mo

Extrait

Melanin in the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus:
Discovery of a novel melanin in the fungus and the use of conidial
melanin as a target for camelid heavy-chain antibodies








Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)



vorgelegt dem Rat der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät der
Friedrich-Schiller-Universität Jena







von
Dipl.-Apothekerin Jeannette Christina Schmaler-Ripcke
geboren am 23.11.1979 in Hoyerswerda






2009



























1. Gutachter: Prof. Axel A. Brakhage, Jena
2. Gutachter: Prof. Bernhard Hube, Jena
3. Gutachter: Prof. Gerhard Braus, Göttingen

Datum der öffentlichen Verteidigung: 1. Dezember 2009Abstract I
ABSTRACT
The most important air-borne fungal pathogen, Aspergillus fumigatus, is the causative
agent of invasive aspergillosis. This disease is often fatal for immunocompromised patients
due to the difficult diagnosis and limited therapy. The biosynthesis of the pigment
dihydroxynaphthalene (DHN) -melanin is an important virulence determinant of this
fungus. DHN-melanin is predominantly present in conidia, and it may be produced during
infection to protect the fungus from the host immune system.
This work aimed at: (i) studying the role of melanisation as pathogenicity mechanism
and (ii) detecting the fungus with the help of a melanin specific antibody. For this purpose,
an in vitro method for the selection of recombinant antibodies against conidial structures
was developed and techniques for the characterisation and application were established.
Conidia were chosen as antigen presenting structure since they expose DHN-melanin in its
natural conformation. A competitive selection with conidia of the DHN-melanin lacking pksP
mutant strain was performed to minimise the selection against other surface structures. A
recombinant library of camelid VHH domains served as an antibody pool for the selection
via phage-display.
A camelid antibody domain was successfully selected against melanised conidia applying
a newly developed filtration approach. Its recombinant production in Escherichia coli by
high cell density fermentation provided a pure antibody and its fusion to alkaline
phosphatase re-established the bivalency of natural camelid heavy-chain antibodies. The
purified antibody bound with high affinity to melanised conidia of different Aspergillus
species. A less stringent binding to synthetic DOPA-melanin and Sepia-melanin was
observed in ELISA studies. Furthermore, the biotinylated antibody demonstrated
melanisation of conidia and hyphae by an immunofluorescent staining approach.
Pigmentless hyphae from in vitro-grown cultures did not show an immunofluorescent signal
for melanin. Thus, the potential of the established filtration method for the selection and
characterisation of recombinant antibodies against conidial structures was shown by the
successful generation of a camelid domain antibody against conidial melanin.
Furthermore, melanisation of A. fumigatus was studied by means of deletion mutants of
genes coding for key enzymes of the DHN-melanin and pyomelanin pathway. The loss of a
functional Arp2 enzyme, a reductase involved in the DHN-melanin biosynthesis, did not
result in a distinct phenotype from wild type despite the colour change of the conidia from
grey-green to pinkish. The sensitivity to reactive oxygen intermediates (ROI), the growth
rate, the conidial surface morphology and the virulence in a low dose mouse infection model Abstract II
resembled the wild-type characteristics. Hence, the modified DHN-melanin is as protective
as the grey-green wild-type pigment and it allows the exposition of hydrophobins on the
conidial surface contrary to the pksP mutant strain.
To investigate the biological role of the pyomelanin, an alternative melanin produced by
a different pathway starting from L-tyrosine, the genes encoding homogentisate
dioxygenase (HmgA) and 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HppD) were deleted.
Comparable FTIR spectroscopy of synthetic pyomelanin and pigment extracted from
A. fumigatus cultures confirmed the identity of the observed pigment as pyomelanin. In the
hmgA deletion strain, HmgA activity was abolished and the accumulation of homogentisic
acid triggered an increased pigment formation. However, a pigment deposition did neither
alter the surface structure of hyphae nor of conidia. By contrast, homogentisic acid and
pyomelanin were not present in culture supernatants of an hppD deletion mutant which was
confirmed by HPLC and spectroscopic analysis. Germlings of the hppD deletion mutant
showed an increased sensitivity to ROI in two independent assays. The transcription of both
studied genes was induced by L-tyrosine in liquid cultures. The fusion of the hppD-promotor
to gfp revealed the transcriptional activation of hppD in conidia, germlings, hyphae and
conidiophores. Despite activation of the genes during infiltrational growth in the mouse lung
and the increased sensitivity of the hppD strain to ROI, the mutant was not attenuated in its
virulence in the mouse infection model. The loss of both melanins in a double deletion
mutant revealed phenotypical characteristics similar to each single deletion mutant.
In the present study the occurrence of a second type of melanin in A. fumigatus was
demonstrated. Homogentisic acid was shown to be the major intermediate in the L-tyrosine
degradation pathway which yields in the formation of pyomelanin. No clear evidence could
be provided for the involvement of pyomelanin in the pathogenicity of A. fumigatus.
Kurzzusammenfassung III
KURZZUSAMMENFASSUNG
Aspergillus fumigatus ist der bedeutendste, über die Luft verbreitete, opportunistisch
pathogene Pilz und verursacht die invasive Aspergillose. Die schwierige Diagnose und die
limitierte Therapie tragen bei immunsupprimierten Patienten zu einer hohen Letalität bei.
Die Biosynthese von Dihydroxynaphthalen (DHN) -Melanin ist ein wichtiger Virulenzfaktor
dieses Erregers. DHN-Melanin ist vorwiegend in den Konidien vorhanden und wird
wahrscheinlich während der Infektion zum Schutz des Erregers vor dem Immunsystem des
Wirtes gebildet.
Die vorliegende Arbeit verfolgte zwei Hauptziele: (i) die Aufklärung der Bedeutung der
Melanisierung für die Virulenz und (ii) die Detektion des Pilzes mittels eines
melaninspezifischen Antikörpers. Für das letztere Ziel wurden Methoden für die Selektion
eines rekombinanten Antikörpers gegen Oberflächenstrukturen von Konidien und für
dessen Charakterisierung und Anwendung entwickelt. Konidien dienten zur
Antigenpräsentation, da sie Melanin in seiner natürlichen Konformation exponieren. Die
kompetitive Selektion mit Konidien der pksP Mutante, die kein DHN-Melanin synthetisiert,
verfolgte den Ausschluss der Selektion gegen andere Oberflächenstrukturen. Die
Präsentation des Antikörperpools, bestehend aus einer rekombinanten Bibliothek von VHH-
Regionen der heavy-chain Antikörper der Camelidae, erfolgte über phage display.
Ein Kamelantikörperfragment wurde erfolgreich mit Hilfe einer neu entwickelten
Filtrationsmethode gegen melanisierte Konidien selektiert und durch die rekombinante
Produktion in Escherichia coli und Hochzelldichtefermentation in reiner Form dargestellt.
Die Fusion mit der alkalischen Phosphatase bildete die natürliche Bivalenz der heavy-chain
Antikörper nach. Der gereinigte Antikörper zeigte eine hohe Affinität zu melanisierten
Konidien verschiedener Aspergillen. Ferner demonstrierte der biotinylierte Antikörper die
Melanisierung von Hyphen und Konidien mit Hilfe der Immunfluoreszenz wohingegen
melaninfreie Hyphen nicht detektiert wurden. Demzufolge konnte das Potenzial der
entwickelten Selektions- und Charakterisierungsmethode durch die erfolgreiche
Generierung eines gegen Melanin gerichteten Kamelantikörpers gezeigt werden.
Weiterhin wurden zentrale Enzyme der DHN- und Pyomelaninbiosynthese zur
Charakterisierung der Melanisierung von A. fumigatus deletiert. Der Verlust der Arp2
Reduktase der DHN-Melaninbiosynthese verursachte einen dem Wildtyp ähnlichen
Phänotyp. Bis auf die pinke Konidienfarbe, entsprachen die Empfindlichkeit gegenüber
reaktiven Sauerstoffintermediaten (ROI), die Wachstumsrate, die Oberflächenstruktur der Kurzzusammenfassung IV
Konidien und die Virulenz im Mausinfektionsmodel dem Wildtypphänotyp. Folglich weist
das modifizierte Pigment eine ebenso protektive Wirkung wie das Wildtyppigment auf.
Um die Rolle des, von der Anwesenheit von Tyrosin abhängigen, Pigments zu
untersuchen, wurden Deletionsmutanten der p-Hydroxyphenylpyruvatdioxigenase (HppD)
und der Homogentisatdioxigenase (HmgA) generiert. In der hmgA Deletionsmutante
bewirkte die Akkumulation von Homogentisinsäure eine verstärkte Pigmentbildung, jedoch
verursachte die Pigm