Modification of metabolic pathways by anabolic agents and identification of gene expression biomarkers [Elektronische Ressource] / Martina Reiter

Martina Reiter

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• Publié par: technische_universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 27
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 1 Mo

Extrait

Technische Universität München
Lehrstuhl für Physiologie


Modification of metabolic pathways by anabolic agents and identification of
gene expression biomarkers

Martina Reiter




Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für
Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zur Erlangung
des akademischen Grades eines


Doktors der Naturwissenschaften (Dr.rer.nat)


genehmigten Dissertation.








Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. Th. Knoke

Prüfer der Dissertation: 1. Univ.-Prof. Dr. H.H.D. Meyer
2. Univ.-Prof. Dr. J. Polster
3. Priv.-Doz. M. W. Pfaffl







Die Dissertation wurde am 16.04.2008 bei der Technischen Universität München eingereicht
und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung
und Umwelt am 03.07.2008 angenommen.











Wissenschaft –

Einem ist sie die hohe, die himmlische Göttin,
dem Andern eine tüchtige Kuh, die ihn mit Butter versorgt.

(Friedrich Schiller) Contents

TABLE OF CONTENTS
ABBREVIATIONS III
ZUSAMMENFASSUNG VI
ABSTRACT VIII
1. INTRODUCTION 1
1.1 ANABOLIC AGENTS 1
1.1.1 MISUSE OF ANABOLIC AGENTS IN SPORTS 4
1.1.2 APPLICATION AND MISUSE OF ANABOLIC AGENTS IN ANIMAL HUSBANDRY 5
1.1.3 CLINICAL APPLICATION OF ANABOLIC AGENTS 6
1.2 THE IDEA OF BIOMARKERS 7
1.3 AIMS 11
2. MATERIAL AND METHODS 13
2.1 STUDIES ON BOVINE TISSUES 13
2.2 STUDIES ON PRIMATE TISSUES 13
2.3 STUDIES ON HUMAN TISSUES 14
2.3.1 CELL CULTURE EXPERIMENTS 14
2.3.2 HAIR FOLLICLE EXPERIMENTS 16
2.4 RNA EXTRACTION, RNA QUALITY 16
2.5 SELECTION OF TARGET GENES 17
2.6 PRIMER DESIGN AND AGAROSE GEL ELECTROPHORESIS 21
2.7 REAL-TIME QRT-PCR 22
2.8 DATA ANALYSIS AND STATISTICS 23
3. RESULTS AND DISCUSSION 25
3.1 STUDIES ON BOVINE TISSUES 25
3.2 STUDIES ON PRIMATE TISSUES 30
3.3 STUDIES ON HUMAN TISSUES 37
3.3.1 CELL CULTURE EXPERIMENTS 37
3.3.2 HAIR FOLLICLE EXPERIMENTS 42
4. CONCLUSION 46
REFERENCE LIST 50
IContents

ACKNOWLEDGMENTS 56

SCIENTIFIC COMMUNICATIONS 57

CURRICULUM VITAE 59

APPENDIX 60

IIAbbreviations

ABBREVIATIONS


AAS anabolic androgenic CTSB cathepsin B
substances
CTSL cathepsin L
ACADvl acyl-CoA-dehydrogenase
C.V. coefficient of variation
ACC.NR. accession number
CyP1A1 cytochrome P1
ACTA1 α-actin
DNA desoxyribonucleic acid
ACTB β-actin
EDTA ethylenediaminetetraacetic
ADI acceptable daily intake acid

AM arithmetic mean e.g. example given

Enoyl-CoA enoyl-CoA-hydratase Angpt angiopoetin

ER estrogen receptor AR androgen receptor

AT annealing temperature EU European Union

FAO food and agriculture bp base pairs
organisation
Bcl-2 b-cell leucemia/lymphoma 2
FasL death receptor ligand


Bcl-xl bcl-xl protein
FasR death receptor


BW body weight
FCS fetal calf serum


CALR calreticulin
FDA food and drug administration


CAPN3 calpain 3
FGF fibroblast growth factor


CAST calpastatin FGFR fibrolblast growth factor

receptor
CDH15 m-cadherin

FLK-1 vascular endothelial growth
CDK2 cyclin-dependent kinase 2
factor receptor


c-fos c-fos protein for forward primer


c-jun c-jun protein
GAPDH glyceraldehyde-3-

phosphate dehydrogenase
CK creatin kinase


GC gas chromatography
Cox cyclo-oxogenase


GDF8 myostatin
CRL community reference

laboratory
GHR growth hormone receptor


Ct crossing point
GLUT glucose transporter


IIIAbbreviations

GR glucocorticoid receptor MyoG myogenin

HBSS hank's buffered salt solution NCBI national center for
biotechnology information
HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-
piperazineethanesulfonic acid n.m. not measured

HF hair follicle NRL national reference laboratory

HFDPC hair follicle dermal papilla NT neurotrophin
cells
OD optical density
HGF hepatocyte growth factor
p53 tumor supressor
HK hexokinase
PCR polymerase chain reaction
HRE hormone responsive element
PPIA cyclophilin A
HSD17b 17 β-hydroxy-steroid-
PRLR prolactin receptor dehydrogenase

qRT-PCR quantitative reverse- Hsp heat shock protein
transcription polymerase
chain reaction IGF1 insulin like growth factor 1

PYGM glycogen phosphorylase IGF1R insulin like gr
receptor
rev reverse primer
IGFBP insulin like growth factor
RG reference gene binding protein

IL interleucin RGI RG-Index

RIN RNA integrity number IOC international olympic
committee
RT reverse transcription
IR insulin receptor
mRNA messenger ribonucleic acid
JECFA joint FAO/WHO expert
SARM selective androgen receptor committee on food
modulator additives

S.D. standard deviation LDH lactate-dehydrogenase

s.r. significantly regulated MGA melengestrol acetate

MMP matrix metalloproteinase SRD5A steroid-5 α-reductase

MS mass spectrometry TAT tyrosin-amino-transferase

Myf myogenic factor TBA trenbolone acetate

MYHC2x myosin heavy chain T/E testosterone/epitestosterone
ratio
MyoD myogenic differenciation
factor
IVAbbreviations

TE-buffer trishydroxymethyl-
aminomethane/ ethylene-
diaminetetraacetic acid buffer

TIMP matrix metalloproteinase
inhibitor

TG target gene

T/LH testosterone/luteinizing
hormone ratio

Tm melting temperature

TM treatment

TNF tumor necrosis factor

trt treatment

TU technical university

UBC ubiquitin

USA United States of America

UV ultra violet

VEGF vascular endothelial growth
factor

v-myb myeloblastosis viral oncogene

WADA world anti doping agency

WHO world health organisation

YWHAZ tyrosine 3-monooxygenase/
tryptophan 5-monooxygenase
activation protein

Z zeranol
VZusammenfassung

ZUSAMMENFASSUNG

Der Begriff anabole Wirkstoffe umfasst alle anabolen androgenen Steroide (AAS) und andere
anabole Wirkstoffe. Diese Substanzen werden wegen ihrer anabolen Wirkung eingenommen,
welche einen Zuwachs an Muskelmasse, eine Reduzierung der Fettmasse, eine positive
Stickstoffbilanz und eine allgemeine Leistungssteigerung bewirken soll.
AAS finden im Leistungssport Anwendung, wobei die Einnahme im Profisport illegal ist und
geahndet wird. Bei Lebensmittel liefernden Tieren ist der Einsatz anaboler Substanzen in
Ländern wie den USA und Kanada legal, in der EU jedoch verboten. Anabole androgene
Substanzen finden auch in der medizinischen Therapie ihren Platz. Hier werden sie
überwiegend für die Behandlung von Osteoporose bei Frauen und Hypogonadismus beim
Mann eingesetzt. Eine Behandlung mit anabolen Stoffen hat meist auch Nebenwirkungen zur
Folge, weshalb neue Substanzen, so genannte SARM (selective androgen receptor
modulators) entwickelt wurden. Diese Substanzen sollen dieselbe anabole Wirkung wie das
Androgen Testosteron aufweisen, jedoch geringere Nebeneffekte zeigen.
Verschiedenste Methoden um anabole Wirkstoffe nachzuweisen wurden entwickelt, meist
basierend auf Massenspektrometrie, welche die direkte Analyse des Wirkstoffes erlaubt. Es ist
allerdings auch bekannt, dass anabole Wirkstoffe bereits die mRNA Expression in der Zelle
beeinflussen können, weshalb die Wirkung dieser Stoffe mittels mRNA-Expressionsanalysen
messbar sein sollte.
Konkrete Zielsetzung dieser Arbeit war es festzustellen, ob AAS mit Hilfe von Gen-
Expressionsanalysen in verschiedenen Geweben und Spezies nachzuweisen sind. Durch die
Identifizierung von Biomarkern, gemessen mittels qRT-PCR sollte die Entwicklung eines
Expressionsmusters, speziell für AAS möglich sein. Ebenso sollten die physiologischen
Auswirkungen der Substanzen im Organismus, hervorgerufen durch die anabolen Stoffe
aufgezeigt werden. Dafür wurden verschiedene Gewebe, welche alle direkt oder indirekt unter
dem Einfluss von anabolen androgenen Stoffen stehen, wie etwa der Uterus, die Leber,
Muskeln und Haarfollikel analysiert und nach möglichen Biomarkern und physiologischen
Signalwegen geforscht. Die Zielgene wurden in funktionelle Gruppen eingeteilt, um später die
Identifizierung metabolischer Veränderung zu erleichtern.
Ers