187 pages
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Modifications post-traductionnelles des protéines contractiles cardiaques : nouveaux biomarqueurs du remodelage ventriculaire post-infarctus, Phosphorylation and O-GlcNAcylation modulation of contractile proteins in heart failure

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Description

Sous la direction de Christophe Bauters
Thèse soutenue le 18 octobre 2010: Lille 2
Le remodelage ventriculaire gauche (RVG) est un processus complexe qui intervient après un infarctus du myocarde chez 30% des patients en dépit des meilleurs traitements connus actuellement. Le but de mon travail de thèse consistait à identifier les déterminants moléculaires du RVG dans le but de mieux en comprendre les mécanismes physiopathologiques. Pour cela, nous avons étudié les modifications post-traductionnelles des protéines contractiles du VG et en particulier, la phosphorylation et la O-N-acétylglucosaminylation (O-GlcNAc). Nous nous sommes ensuite particulièrement intéressés à la troponine T (TnT) pour laquelle nous avons ainsi pu mettre en évidence une diminution de la phosphorylation au niveau de la sérine 208 au niveau du VG et du plasma chez le rat, suggérant que cela pourrait être un marqueur du RVG post-infarctus. Pour cette étude, nous avons travaillé en collaboration avec l’unité INSERM U644 de Rouen sur un modèle expérimental d’insuffisance cardiaque. L’infarctus du myocarde est induit chez le rat par ligature de la branche descendante de l’artère coronaire gauche, les rats témoins subissant l’intervention mais sans ligature. Dans un premier temps, nous avons réalisé une étude globale du phosphoprotéome du VG en phase tardive du RVG (2 mois post-ligature). Pour cela, les protéines extraites du VG ont été séparées par électrophorèse bidimensionnelle puis colorées au Pro-Q®Diamond (spécifique des protéines phosphorylées) puis au Sypro®Ruby (spécifique des protéines totales). Par analyse bioinformatique, nous avons mis en évidences 69 spots polypeptidiques présentant des modulations de phosphorylation. Nous avons donc analysé ces spots par spectrométrie de masse et avons identifié 30 protéines correspondant à 53 spots polypeptidiques présentant des modulations de phosphorylation. Parmi ces protéines, nous avons choisi de nous concentrer et d’étudier 6 protéines contractiles : la TnT, l’alpha-tropomyosine 1 (α-Tm 1), la desmine, l’αB-crystalline et les chaînes légères de myosine 1 et 2 (MLC). Pour chacune de ces protéines, nous avons identifié le type d’acide aminé responsable de la phosphorylation et quantifié les modulations de phosphorylation dans le VG des rats insuffisants cardiaques (IC). De manière intéressante, nous avons observé que le VG des animaux IC présentait une diminution significative de la phosphorylation sur les résidus sérine pour l’α-Tm 1, la TnT et la MLC-2 et sur les résidus de tyrosine pour l’αB-crystalline ainsi qu’une augmentation significative de la phosphorylation sur les résidus tyrosine pour la MLC-1 et sur les résidus de sérines pour la desmine, confirmant ainsi les résultats obtenus en électrophorèse bidimensionnelle. Afin de compléter l’analyse des modifications post-traductionnelles, nous avons étudié les modifications de O-GlcNAc pour chacune de ces protéines. Nous avons ainsi observé une diminution significative de la O-GlcNAcylation de l’α-Tm 1, de la desmine et l’αB crystalline ainsi qu’une augmentation de la O-GlcNAcylation de la MLC-3 et de la TnT. Par ailleurs, nous avons pu corréler ces modulations de phosphorylation et de O-GlcNAcylation avec des modulations de l’activité des enzymes impliquées dans ces modulations. En effet, par analyse bioinformatique de la séquence de la TnT et par recherche bibliographique nous avons mis en évidence que la protéine kinase C et la protéine phosphatase 2A pourrait être impliquées dans ces modulations de phosphorylation. Nous avons alors mis en évidence une diminution de l’activité de la protéine kinase C epsilon dans le VG des rats IC mais sans variation de l’activité de la protéine phosphatase 2A. Par ailleurs, nous avons mis en évidence une augmentation de l’activité de la O-GlcNAc transférase et une diminution de l’activité de la O-GlcNAcase dans le VG des rats IC. Afin d’étudier les conséquences de ces modifications post-traductionnelles sur la fonction cardiaque, nous avons également utilisé un modèle de cœur isolé perfusé de rats par l’appareil Langendorff pour évaluer la fonction ventriculaire gauche en relation avec les modifications post-traductionnelles des protéines contractiles. La technique de cœur isolé perfusé nous a permis d’effectuer l’enregistrement des pressions du VG ainsi que des constantes de contractilité et de relaxation cardiaque. Nous avons étudié l’effet des modifications post-traductionnelles sur la fonction cardiaque par injection d’inhibiteurs spécifiques de l’isoforme ε de la protéine kinase C (peptides ε V1-2) afin de mimer une diminution de la phosphorylation et par injection d’inhibiteurs spécifiques de la O-GlcNAcase (PUGNAc) afin de mimer une augmentation de la O-GlcNAcylation. Nous avons ainsi évalué la fonction cardiaque dans des groupes d’animaux sains traités ou non par inhibiteurs mais également dans des groupes d’animaux IC traités ou non par inhibiteurs afin d’évaluer les effets bénéfiques ou délétères de ces traitements sur l’insuffisance cardiaque. L’étude globale du phosphoprotéome du VG nous a permis d’observer une diminution significative de la phosphorylation de la TnT sur la sérine 208 chez les rats IC. Nous avons donc synthétisé un peptide représentatif de cette séquence pour produire des anticorps dirigés spécifiquement contre la TnT phosphorylée en S208 (AC :P50753). Nous avons ainsi étudié la TnT phosphorylée en S208 ainsi que la forme O-GlcNAc de la TnT dans le plasma des rats IC. Nous avons mis en évidence à la fois une diminution de la TnT phosphorylée en S208 et une augmentation de la TnT O-GlcNAc dans le plasma des rats IC, suggérant que ces modifications pourraient être considérées comme marqueurs potentiels du RVG. Au vu de ces résultats, nous avons quantifié la TnT phosphorylée en S207 chez l’homme (AC : P45375) et la TnT O-GlcNAc dans deux populations indépendantes de patients coronariens présentant différents degrés de RVG (faible, intermédiaire et élevé). Nous avons ainsi observé une diminution significative de la TnT phosphorylée en S207 dans le plasma des patients présentant un RVG intermédiaire à élevé mais sans variation significative du niveau de TnT O-GlcNAc. Ces résultats suggèrent que la TnT phosphorylée en S207 pourrait être un biomarqueur du RVG. En conclusion, nous avons mis en évidence par analyse phosphoprotéomique globale des modulations du niveau de phosphorylation des protéines contractiles lors du RVG post-infarctus dans un modèle expérimental. Nous avons ensuite mis en évidence une balance phosphorylation / O-GlcNAc de la TnT en S208 dans le VG et dans le plasma des rats IC à 2 mois post-infarctus. Enfin, nous avons observé les mêmes modulations de phosphorylation chez l’homme et ainsi mis en évidence que la diminution de la phosphorylation de la TnT en S207 pourrait être un biomarqueur du RVG.
-Remodelage ventriculaire gauche
Despite significant improvements in management of myocardial infarction (MI), left ventricular remodelling (LVR) remains a major complication and a strong predictor of both heart failure (HF) and death after MI. Although several variables, such as MI size, have been identified as risk factors, LVR remains difficult to predict in clinical practice. Better prediction could allow an individualized approach with more intense therapy and follow-up for such high-risk patients. The aim of my work is to identify molecular determinants of LVR to have a better understanding of physiopathological mechanisms of LVR. For that purpose, we studied post-translational modifications of contractile proteins in particular, phosphorylation and O-N-acetylglucosaminylation (O-GlcNAc). Then, we studied particularly troponin T (TnT) for which we could highlight a decrease of phosphorylation of serine 208 in LV and plasma of MI-rats. These results suggest that the level of circulating phosphorylated troponin T could be new biomarker of LVR and may help to predict the development of heart failure after MI. For this study, we worked in collaboration with INSERM unit U644 at Rouen using an experimental model of HF. MI was induced in rat by left coronary ligation and, the control rats undergoing the surgery without ligation. Initially, we performed differential phosphoproteomic study of LV in the late phase of the LVR (2 months post-MI). For this purpose, LV proteins were extracted and separated by two-dimensional electrophoresis. Gels were first stained by Pro-Q®Diamond (specific of phosphorylated proteins) and then by Sypro®Ruby (specific of total proteins). By bioinformatic analysis, we showed that 69 polypeptidic spots were modulated for their phosphorylation levels. We analyzed these spots by mass spectrometry and identified 30 proteins corresponding to 53 spots with modulationof phosphorylation. Among these proteins, we have chosen to study 6 contractile proteins: TnT, alpha-tropomyosin 1 (Tm-α1), desmin, αB-crystallin and myosin light chains 1 and 2 (MLC). For each described proteins, we have validated the modulation of phosphorylation and determined the aminoacid involved in the phosphorylation modulation using immunoprecipitation techniques with specific antibodies against the proteins and phospho-Tyrosine, -Threonine and –Serine antibodies confirming the screening performed by 2D-electrophoresis for the detection of phosphoproteins. We observed a significant decrease of phosphorylation on serine for Tm-α1, TnT and MLC-2 and on tyrosine residues for αB-crystallin as well as a significant increase in phosphorylation on tyrosine for MLC-1 and on serine residues for desmin, thus confirming the results obtained in two-dimensional electrophoresis. In order to complete analysis of the post-translational modifications, we studied the modifications of O-GlcNAc for each one of these proteins. We thus observed a significant decrease in O-GlcNAcylation of Tm-α1, αB-crystallin and desmin as well as an increase in O-GlcNAcylation of the MLC-3 and TnT. In addition, we have correlated these modulations of phosphorylation and O-GlcNAcylation levels with modulations of the activity of enzymes implied in these modulations. Indeed, by bioinformatic analysis of the TnT sequence and literature review, we highlighted that the protein kinase C and the protein phosphatase 2A could be implied in these modulations. We observed a decrease of protein kinase C epsilon isoform expression in the LV of MI- rats without modulation of protein phosphatase 2A activity. In addition, we showed an increase in the activity of O-GlcNAc transferase and a decreaseof O-GlcNAcase activity in LV of MI rats. Furthermore, left ventricular function was assessed in vitro using a Langendorff preparation of rat perfused heart, in order to determine cardiac contractility and relaxation to correlate them to the modulation of post-translational modifications of the proteins selected. The isolated perfused heart technique enabled us to study the LV pressures as well as cardiac contractility and relaxation. We studied effect of the post-translational modifications on the cardiac function by injection of specific inhibitors of the protein kinase C epsilon (peptides ε V1-2) or O-GlcNAcase (PUGNAc). We evaluated cardiac function in groups of control animals treated or not by inhibitors but also in MI rats treated or not by inhibitors. With global phosphoproteomic study, we observed a significant decrease of TnT phosphorylation on serine 208 in MI rats. We synthesize peptide of the TnT sequence in order to produce antibodies directed specifically against TnT phosphorylated in S208 (AC:P50753). We have studied phosphorylated TnT in S208 as well as O-GlcNAcylation status of TnT in the plasma of rats. We show a decrease in phosphorylated TnT in S208 and an increase in TnT O-GlcNAc in the plasma of MI rats, suggesting that these modifications could be considered as potential biomarkers of the LVR. Finally, we quantified phosphorylated TnT in S207 in human (AC: P45375) and TnT O-GlcNAc in two independent populations of patients with various levels of LVR (low, intermediate and high). We observed a significant decrease in phosphorylated TnT in S207 in the plasma of patients with intermediate and high LVR without significant modulation of the TnT O-GlcNAc levels. These results suggest that phosphorylation TnT in S207 could be a biomarker of the LVR. In conclusion, we show modulations of the phosphorylation level of 6 contractile proteins with LVR by global phosphoproteomic analysis. We show interplay between phosphorylation and O-GlcNAcylation levels of TnT in S208 in the LV and plasma of MI rats at 2 months post-ligation. Finally, we found these modulations in human plasma and show that diminution of phosphorylated TnT in S207 could be a marker of the LVR.
Source: http://www.theses.fr/2010LIL2S023/document

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