Modified poly(ethylene imines) for plasmid delivery [Elektronische Ressource] : physico-chemical and in vitro/in vivo investigations / vorgelegt von Michael Neu

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• Publié par: philipps-universitat_marburg
• Publié le: 01 janvier 2006
• Nombre de lectures: 30
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 1 Mo

Extrait

Modified Poly(ethylene imines)
for plasmid delivery:

Physico-chemical and
in vitro/in vivo investigations







Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)



dem

Fachbereich
der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von

Michael Neu

aus Zweibrücken




Marburg/Lahn 2006







































Vom Fachbereich Pharmazie der Philipps-Universität Marburg als Dissertation am
18.10.2006 angenommen.

Erstgutachter: Prof. Dr. Thomas Kissel

Zweitgutachter: Prof. Dr. Udo Bakowsky


Tag der mündlichen Prüfung am 22.11.06

















Die vorliegende Arbeit entstand
auf Anregung und unter Leitung von

Herrn Prof. Dr. Thomas Kissel

am Institut für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie
der Philipps-Universität Marburg.





















Meiner Familie

In Liebe und Dankbarkeit Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Thomas Kissel für die Betreuung meiner
Doktorarbeit und sein in mich gesetztes Vertrauen. Sein großer Erfahrungsschatz und
die stete Diskussionsbereitschaft haben maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit
beigetragen. Er war stets ein verständnisvoller und motivierender Doktorvater für mich
und hat es mir ermöglicht, verschiedenste Themen kennen zu lernen und mit
Arbeitsgruppen anderer Fachbereiche zusammenzuarbeiten.
Prof. Dr. Udo Bakowsky danke ich für die Erstellung des Zweitgutachtens sowie die
Diskussionsbereitschaft und seinen Ideenreichtum im Zusammenhang mit
Rasterkraftmikroskopischen Untersuchungen.
Prof. Dr. Voigt vom Institut für Physiologie und Pathophysiologie möchte ich für die
Möglichkeit danken, in seinem Tierlabor zu arbeiten.
Dr. Martin Behe vom Institut für Nuklearmedizin möchte ich nicht nur für die
angenehme und produktive Zusammenarbeit aufs herzlichste danken, sondern auch für
seine immer freundliche und motivierende Art. Stets hat er mit vielen guten Ideen die
Radioaktivarbeiten mit Tieren angenehmer gemacht.
Allen Kollegen in Marburg danke ich für die schöne gemeinsame Zeit.
Für die Hilfe beim Erlernen neuer Methoden und die stete Unterstützung während
meiner ersten Zeit in Marburg danke ich meinen ehemaligen Kollegen PD Dr. Dagmar
Fischer, Dr. Thomas Merdan, Dr. Shintao Shuai, Dr. Shirui Mao, Dr. Julia Schnieders,
Dr. Christine Oster, Dr. Carola Brus, Dr. Matthias Wittmar, Dr. Ullrich Westedt und Dr.
Michael Simon. Für die erfolgreiche Zusammenarbeit und die ausführlichen
Diskussionen möchte ich den Mitgliedern der „PEI-Gruppe“ Oliver Germershaus,
Juliane Nguyen und Olivia Merkel danken, besonders meiner „TAT-PEI-Kollegin“ Dr.
Elke Kleemann. Die vielen schönen Stunden mit ihnen und meinen Kollegen Sascha
Maretschek, Nina Seidel, Frank Morell, Claudia Packhäuser, Regina Reul und Tobias
Lebhardt während und nach der Arbeit, werden mir immer als schöne Erinnerung
bleiben. Gleiches gilt für die Kollegen aus dem Arbeitskreis von Prof. Bakowsky,
Anette Sommerwerk, Jens Schäfer, Eyas Dayyoub und Nico Harbach, sowie Johannes
Sitterberg, der mit viel Elan und Zeitaufwand die rasterkraftmikroskopischen
Untersuchungen durchführte. Besonderer Dank gilt Dr. Lea Ann Dailey sowie Dr. Eric Rytting für die sorgfältige
Revision der englischsprachigen Manuskripte.
Weiterhin gilt mein Dank Eva Mohr und Nicole Bamberger für ihre ausgezeichnete
Arbeit in der Zellkultur sowie Gudrun Hohorst vom Institut für Physiologie sowie
Gudrun Höhn und Ursula Cramer aus dem Nuklearmedizin für ihre wertvolle
Unterstützung bei Tierexperimenten. Klaus Keim danke ich für die Unterstützung in
allen grafischen Belangen, Herrn Lothar Kempf für die Aufrechterhaltung des Betriebs
unserer Geräte und die Fertigung mehrerer Hilfsmittel.
An dieser Stelle möchte ich meinen liebevollen Eltern für ihre stete Unterstützung und
ihr Verständnis für all meine Entscheidungen danken.
Zuletzt, doch am allermeisten, danke ich Yvonne Fridrich von ganzem Herzen, die mich
die ganze Zeit über unterstützt hat, um diese Arbeit zu verwirklichen.
TABLE OF CONTENTS
INTRODUCTION 9
OBJECTIVES OF THIS WORK 10
Recent advances in rational gene transfer vector design based on
poly(ethylene imine) and its derivatives 12
Summary 13
Introduction 14
PEI: Polymer structure and molecular weight 15
Polyplexes of PEI with DNA 18
Variations of the basic structure: PEI conjugates 26
Conclusion 43
Nanocarriers for DNA delivery to the lung based upon a TAT-derived
peptide covalently coupled to PEG-PEI 58
Summary 59
Introduction 60
Experimental Section 62
Results and Discussion 69
Conclusion 84
Stabilized nanocarriers for plasmids based upon crosslinked
Poly(ethylene imine) 89
Summary 90
Introduction 91
Experimental Section 93
Results and Discussion 99
Conclusion 115
Bioreversibly crosslinked nanocarriers based upon Poly(ethylene
imine) for systemic plasmid delivery: in vitro characterization and in
vivo studies in mice 122
Summary 123
Introduction 124
Experimental Section 126
Results 130
Conclusion 144

Block-copolymers of PEI and high molecular weight PEG with
extended circulation in blood 150
Summary 151
Introduction 152
Experimental Section 154
Results and Discussion 160
Conclusion 176
SUMMARY AND PERSPECTIVES 182
ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK
SUMMARY 183
PERSPECTIVES 185
ZUSAMMENFASSUNG 188
AUSBLICK 191
APPENDICES 193
ABBREVIATIONS 194
CURRICULUM VITAE5
LIST OF PUBLICATIONS6





INTRODUCTION Objectives
______________________________________________________________________
OBJECTIVES OF THIS WORK

In this dissertation, the development of polyplexes based upon poly(ethylene imine)
(PEI) and plasmid DNA for airway and intravenous application was investigated. The
aim was to construct novel vectors with enhanced stability in the respective
environment and advantageous properties in terms of in vivo application.
The in vivo administration of therapeutic genes is so far hampered by the lack of stable
vector systems that are able to overcome the numerous hurdles on the way to their target
tissue and cells. To address these issues, polyelectrolyte polyplexes between the
polycationic polymer PEI and plasmid DNA, referred to as “polyplexes,” were modified
to circumvent the specific problems of in vivo application.
The respiratory tract presents a barrier between an organism and its environment that
can be exploited for the aerosol administration of biologically active drug substances.
Since polyplexes for lung administration provide an important and rapidly expanding
field for the treatment of various pulmonary diseases, we attempted to design PEI
conjugates for airway administration.
A new vector consisting of a protein transduction domain derived from the HIV TAT
peptide coupled to PEI via a PEG linker is described in Chapter 2. We hypothesized
that the cationic protein transduction domain would promote DNA condensation and
enhance cell uptake, while PEG provided steric shielding to prevent polyplex
aggregation. A broad range of physico-chemical, in vitro and in vivo studies were
undertaken to assess the DNA protection capabilities and the toxicity of these
conjugates. The resulting polyplexes with plasmid DNA were investigated in terms of
cell uptake, biodistribution and transfection capability in vitro and in vivo.
Polyplexes are known to be rapidly cleared from the bloodstream after intravenous
administration. Basically, this was believed to be due their interactions with blood
components and vessel endothelia and by their rapid dissociation in the circulation with
subsequent degradation of the nucleic acids. To address these issues, we constructed a
stabilized vector system by crosslinking the polymer with a low molecular weight
reagent. In Chapter 3, this strategy was systematically investigated. First, the course of
the crosslinking reaction was evaluated. Different molecular weights and formulation
procedures were compared in terms of their impact on polyplex size, surface charge and