Neutron scattering on biological subjects [Elektronische Ressource] : neue Einblicke in die Struktur der Lipidmatrix des Stratum corneum, basierend auf Modellmembranen / von Doreen Kessner geb. Otto

Jens Otto Harry Jespersen

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• Publié le: 01 janvier 2008
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• Langue: Deutsch
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Extrait

Neutron scattering on biological subjects –
Neue Einblicke
in die Struktur der Lipidmatrix des Stratum corneum,
basierend auf Modellmembranen

Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
vorgelegt der
Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Biowissenschaften
der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
von
Frau Diplom-Pharmazeutin Doreen Kessner geb. Otto
geb. am 01.06.1979 in Magdeburg
Gutachter
1. Prof. Dr. Dr. Reinhard Neubert, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
2. Prof. Dr. Bodo Dobner, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
3. Dr. habil. Gerald Brezesinki, MPI für Kolloid- und Grenzflächenforschung Golm

Halle(Saale), 02. Juli 2008
urn:nbn:de:gbv:3-000014080
[http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn=nbn%3Ade%3Agbv%3A3-000014080]Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
I. Einleitung und Zielstellung 10
II. Theoretischer Teil 13
II.1. Aufbau und Funktion der menschlichen Haut 13
II.2. Das Stratum corneum 15
II.2.1. Struktur und Funktion des Stratum corneum 15
II.2.2. Lipidzusammensetzung im Stratum corneum 16
II.3. Physikochemische Eigenschaften der Ceramide und deren Einfluss auf die 20
Struktur des SC – Part I: Physikochemische Eigenschaften der Ceramide
II.4. Physikochemir Ceramide und de23
Struktur des SC – Part II: Stratum corneum Lipid Modellsysteme
II.5. Neutronenstreuung in der Stratum corneum Forschung 29
II.5.1. Grundlagen der Methode 29
II.5.2. Neutronenstreustudien an Stratum corneum Lipid-Modellsystemen 34
II.5.3. Postulation des armature reinforcement Modells 39
II.6. Weitere Methoden zur Charakterisierung des physikochemischen Ver- 41
haltens der Ceramide als wichtige Stratum corneum Lipide
II.6.1. Lyotrope flüssigkristalline Zustände 41
II.6.2. Grundlagen der eingesetzten Methoden 43
II.6.2.1. Röntgenbeugung 43
II.6.2.2. IR-und Raman-Spektroskopie 44
III. Experimenteller Teil 49
III.1. Verwendete Substanzen und Chemikalien 49
III.1.1 Synthese und Analytik der Ceramide CER[NS], CER[NS]-D2, 53
CER[NS]-D3 und CER[NS]-D47
III.2. Methoden 62
III.2.1. Neutronendiffraktion 62
III.2.1.1. Probenpräparation für Neutronenstreuexperimente 64
III.2.2. Röntgenpulverdiffraktion 65
III.2.2.1. Probenpräparation für Röntgendiffraktionsxperimente 67
III.2.3. FT-Raman-Spektroskopie 67
III.2.4. FT-IR-Spektroskopie 67
III.2.5. Weitere Methoden 6869IV. Ergebnisse und Diskussion
IV.1. Physikochemische Charakterisierung der ω-Acylceramide CER[EOS] 69
und CER[EOP]
69IV.1.1. Röntgendiffraktionsstudien an CER[EOS]
71IV.1.2. Röntgendiffraktionsstudien an CER[EOP]
76IV.1.3. Raman-spektroskopische Untersuchungen an CER[EOS] und
CER[EOP]
81IV.2. Darstellung des CER[NS] und der deuterierten Derivate CER[NS]-D2,
CER[NS]-D3 und CER[NS]-D47
88IV.2.1. Neutronenspektroskopische Untersuchungen an DPPC/
CER[NS]-Modellmembranen
93IV.3. Untersuchungen an SC Lipid-Modellsystemen mittels Neutronen-
Streuung
IV.3.1. Weiterführende Studien am Referenzsystem 93
CER[AP]/CHOL/PA/ ChS
IV.3.1.1. Lokalisation von partiell deuteriertem Cholesterol im 93
quaternären SC Lipid-Modellsystem
IV.3.1.2. Einfluss der Diastereomere D-CER[AP] und L- 99
CER[AP] auf die Membranstruktur
IV.3.2. Entwicklung von SC Lipid-Modellsystemen unter Verwendung 106
des ω-Acylceramid CER[EOS]
IV.3.2.1. Entwicklung eines ternären SC Lipid Modellsystems 106
CER[EOS]/CER[AP]/CHOL
IV.3.2.2. Einfluss der Kopfgruppenstruktur des ω-Acylceramid 113
auf die Membranstruktur – Austausch des CER[EOS]
durch CER[EOP]
IV.3.2.3. Entwicklung des quaternären SC Lipid-Modellsystems 118
CER[EOS]/CER[AP]/CHOL/BA
IV.3.3. Aufbau eines quaternären SC Lipid-Modellsystems 126
CER[NS]/CHOL/BA/ChS
IV.3.4. Einfluss von CER[AP] auf die Mikrostruktur des SC Lipid- 130
Modellsystems: Ein Paradigmenwechsel
V. Zusammenfassung 136
VI. Ausblick 140
VII. Literaturverzeichnis 141
149VIII. Anhang
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Abb. Abbildung
CER Ceramid
CHOL Cholesterol
FFA free fatty acid (freie Fettsäure)
SC Stratum corneum
TEWL Trans epidermal water loss (Transepidermaler Wasserverlust)
δ chemische Verschiebung
DSC Differential Scanning Calorimetry
FT Fourier Transformation
IR Infrarot
LAM Longitudinal akustische Moden (Ramanspektroskopie)
m Multiplett
MS Massenspektrometrie
NMR Nuclear magnetic resonance – Kernspinresonanz
r.H. engl. relative humidity – relativer Feuchtigkeitsgehalt
s Singulett (NMR)
s reziproker Netzebenenabstand (Röntgendiffraktion)
SAXS Small Angle X-ray Scattering
t Triplett
T Temperatur
ttt all-trans Konformation (Ramanspektroskopie)
WAXS Wide Angle X-ray Scattering
θ Streuwinkel theta
λ Wellenlänge
ν Streckschwingungen (symmetrisch; a(nti)symmetrisch) s;a
m SI-Einheit: Masse [g; mg] abs. absolut
CDCl deuteriertes Methanol 3
CHCl Chloroform 3
MG Molekulargewicht [g/ mol]
n SI-Einheit: Stoffmenge [mol; mmol]
P O Phosphorpentoxid 2 5
TEA Triethylamin
THF Tetrahydrofuran
THP- (Tetrahydro-2H-pyran-2-yl-)oxy-
X Molenbruch
DESY Deutsches Elektronen Synchrotron
HASYLAB Hamburger Synchrotron Strahlungslabor
HMI Hahn-Meitner-Institut Berlin
Abbildungsverzeichnis
Abb.1 Die menschliche Haut (schematische Darstellung)
Abb.2 Schematischer Aufbau der Epidermis
Abb. 3 Vorstellung des Stratum corneums als „brick and mortar“- Modell
Abb.4. Übersicht über die zur Zeit identifizierten Ceramid-Subspezies
Abb.5 Chemische Strukturen von L-CER[AP] und dem natürlich vorkommenden D-CER[AP] nach
Raudenkolb et al. [2005]
Abb.6 Mögliche molekulare Anordnungen des CER[AP] in der multilamellaren Membran nach
Raudenkolb et al. [2005 ] und Kiselev et al. [2005]
Abb.7 Das Stacked Monolayer Model nach Swartzendruber et al. [1989]
Abb.8 Das Domain Mosaic Model nach Forslind [2001]
Abb.9 Das Sandwich Model nach Bouwstra et al. [1998]. Die Nomenklatur erfolgte noch nach dem
alten, auf dem chromatographischen Laufverhalten basierenden System. Nach Motta et al. [1993]
ergibt sich folgende: CER1 = CER[EOS], CER2 = CER[NS], CER3 = CER[NP], CER4 =
CER[AS](C24), CER5 = CER[AS](C16), CER6 = [AP]
Abb.10 Das Single Gel Phase Model nach Norlén [2001]
Abb.11 Schematische Darstellung eines Streu-Experimentes. Der Streuvektor q entspricht der Differenz
zwischen Austritts- und einfallenden Strahls [Grossmann 2002]
Abb.12 Modellvorstellung eines multilamellar orientierten Lipidfilms
Abb.13 Neutronenstreulängedichteprofil ρ (x) der CER[AP]/ CHOL/ PA/ ChS Membran bei 60% r.H., s
T=32°C und bei drei verschiedenen D O-Konz. Zur Illustration sind die charakteristischen 2
Membranbereiche hervorgehoben und die Lokalisierung der Moleküle eingefügt.
Abb. 14 Neutronenstreulängedichteprofil einer DMPC-Membran (60% r.H., T=32°C, 8% D O), aus 2
[Kiselev et al. 2005]
Abb.15 Wasserverteilungsfunktion für die Membran CER[AP]/ CHOL/ PA/ ChS;
Die Wassereindringtiefe entspricht X =15,6 Å HH
Abb.16 Armature reinforcement Modell nach Kiselev [2007] über die Struktur der SC Lipid-
Modellmatrix
Abb. 17 Trans- und gauche-Konformation der Alkylketten
Abb.17a Lamellarphasen
Abb.18 Beugung von Röntgenstrahlen an einem Gitter
Abb. 19 Wechselwirkungen von monochromatischer Strahlung mit Molekülen
Abb.20 V1 Diffraktometer (Foto) [Qelle: www.hmi.de]
Abb.21 HMI- V1 Membrandiffraktometer in schematischer Darstellung (Be-Filter= Beryllium-Filter zur
Erhöhung der Neutronenintensität; Collimator= Erzeugung eines parallelen Strahlenverlaufs;
Monochromator= Isolierung einer bestimmten Wellenlänge aus einer einfallenden Menge
elektromagnetischer Strahlung)

Abb.22 Abhängigkeit des Strukturfaktors vom D 0-Gehalt für die SC Lipid Modellmembran CER[NS]/ 2
CHOL/ BA/ ChS (55/ 25/ 15/ 5%), bei T=32°C; 60% r.H.
Abb.23 Versuchsanordnung am Messplatz A2 (HASYLAB, DESY)
Abb.24 Röntgendiffraktionsmuster von trockenem CER[EOS] bei verschiedenen Temperaturen
Abb.25 Röntgendiffraktionsmuster von hydratisiertem CER[EOS] bei verschiedenen Temperaturen
Abb.26 Röntgendiffraktionsmuster von trockenem CER[EOP] bei verschiedenen Temperaturen Abb.27 Röntgendiffraktionsmuster von hydratisiertem CER[EOP] bei verschiedenen Temperaturen
Abb.28 Temperaturabhängigkeit der d-Werte des 0,45 (durchgezogene Linie) und des 0,38 nm
(gestrichelte Linie) Reflexes.
Abb.29 Raman-Spektren von CER[EOS] trocken bei ausgewählten Temperaturen in den Spektralbereich
-1 -1100- 1650 cm (links) und 2800-3000 cm (rechts)
Abb.30 Temperaturabhängige Änderung der Bandenposition der symmetrischen Valenzschwingung der
Methylengruppen von CER[EOS] trocken
Abb.31 Temperaturabhängige Abnahme der trans-Konformere durch Flächenvergleich der ν (CH )- und as 2
ν (CH )-Banden bei CER[EOS] s 2
Abb.32