NMR-basierte Aufklärung der Strukturen von Ras-Bindedomänen und ihrer Wechselwirkungen mit den kleinen GTPasen H-Ras und Rap1A [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Ralph-Peter Elsner

Administrator

Sujets

• Biologie

Informations

• Publié par: universitat_regensburg
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 13
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 4 Mo

Extrait

NMR-basierte Aufklärung der Strukturen
von Ras-Bindedomänen und ihrer
Wechselwirkungen mit den kleinen
GTPasen H-Ras und Rap1A
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
der naturwissenschaftlichen Fakultät III
- Biologie und Vorklinische Medizin -
der Universität Regensburg
durchgeführt am Institut für Biophysik und physikalische Biochemie
unter Anleitung von
Prof. Dr. Dr. Kalbitzer
vorgelegt von
Ralph-Peter Elsner
aus Regensburg
November 2006Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG 6
2. GRUNDLAGEN 8
2.1. Onkogene der Signaltransduktion 8
2.2. GTP-bindende Proteine 9
2.3. Die Superfamilie der Ras-verwandten Proteine 10
2.4. Das Ras-Protein 11
2.5. Das Ras-verwandte Protein Rap1A 12
2.6. Biologische Funktion von AF6 13
2.6.1.Die Ras-Bindedomäne von AF6 17
2.7. Biologische Funktion des Ras-Effektors Byr2 18
2.7.1.Die bisherige Strukturvorstellung von Byr2-RBD 19
2.8. Der Ras-Effektor Nore1 21
2.8.1.Domänenstruktur von Nore1 23
2.9. NMR-Spektroskopie 24
2.9.1.Physikalische Grundlagen 24
2.9.2.Methodische Entwicklung in der NMR 30
3. METHODEN UND EXPERIMENTE 34
3.1. Strukturaufklärung von AF6-RBD und Byr2-RBD 34
3.1.1.Distanzbeschränkungen 34
3.1.2.Dipolare Kopplungen 35
3.1.3.Einschränkungen für Diederwinkel 35
3.1.4.Strukturrechnung mit CNS 36
3.1.5.Strukturverfeinerung im Lösungsmittel Wasser 39
3.1.6.Beurteilung von Strukturen 40
3.2. Modelle der Komplexstrukturen 42
3.2.1.Bestimmung der AF6-Bindungsfläche für Rap1A und H-Ras 42
3.2.2.Strukturmodell von H-Ras 43
3.2.3.Strukturmodell von Rap1A 44
3.2.4.Docking von AF6 mit H-Ras und Rap1A 44
3.3. Sequentielle Zuordnung von Nore1-RBD 47
3.3.1.Proteinexpression und Isotopenmarkierung 47
3.3.2.Probenzusammensetzung und Spektrenaufnahme 48
3.3.3.NMR-Experimente zur Zuordnung der Resonanzen 49
2Inhaltsverzeichnis
4. NMR-STRUKTUR DER RBD VON AF6 52
4.1. Sekundärstruktur von AF6-RBD 52
4.1.1.Sekundärstrukturvorhersage durch chemische Verschiebung 52
4.1.2.Sekundärstrukturbestimmung durch NOE-Kontakte 53
4.2. Restraints für die Strukturrechnung 55
4.2.1.NOE-Kontakte 55
4.2.2.Wasserstoffbrücken 56
4.2.3.Diederwinkel 57
4.3. Tertiärstruktur der AF6-RBD 57
4.4. Interaktion von AF6 mit H-Ras und Rap1A 66
4.4.1.Docking von AF6 an H-Ras 66
4.4.2.Docking von AF6 an Rap1A 78
4.5. Interaktion von AF6 unter gleichen Bedingungen für H-Ras und Rap1A 90
4.5.1.Dockingprotokoll und Resultate für den Komplex AF6 •H-Ras 91
4.5.2. •Rap1A 100
5. STRUKTURVERFEINERUNG DER RBD VON BYR2 108
5.1. NMR-Struktur der Byr2-RBD vor der Strukturverfeinerung 108
5.2. Ergebnis der Strukturverfeinerung von Byr2-RBD 109
6. STRUKTURELLE UNTERSUCHUNGEN AN NORE1-RBD 117
6.1. Arbeiten zur sequentiellen Zuordnung von Nore1-RBD 117
7. DISKUSSION 121
7.1. Struktur von AF6-RBD 121
7.2. Interaktion von AF6-RBD und H-Ras (s. 4.4.1) 124
7.3. Interaktion von AF6-RBD und Rap1A (s. 4.4.2) 128
7.4. Modellierung der Interaktion von AF6-RBD unter gleichen Bedingungen für die
beiden Ras-Moleküle H-Ras und Rap1A 130
7.5. Strukturverfeinerung von Byr2-RBD 135
7.6. Die sequentielle Zuordnung von Nore1-RBD 137
8. ZUSAMMENFASSUNG 139
9. LITERATUR 141
3Inhaltsverzeichnis
10. ANHANG 150
Promotionsgesuch eingereicht am 21.11.2006
Die Arbeit wurde angeleitet von Prof. Dr. Dr. Kalbitzer
Prüfungsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. Sterner
1. Gutachter: Prof. Dr. Dr. Kalbitzer
2. Gutachter: PD Dr. Rachel
Drittprüfer: Prof. Dr. Brunner
4Inhaltsverzeichnis
1

1 [mit freundlicher Genehmigung von © Kulturrecycling]
5Einleitung
1. Einleitung
Krebs ist eine Erkrankung, deren Ursprung in einer Störung der Kommunikation zwischen
Zellen liegt. Diese Definition impliziert, dass diese Erkrankung nur in einem komplexen
Organismus auftreten kann, dessen Funktionsfähigkeit von einer reibungslosen Interaktion
zwischen seinen Einzelzellen abhängt. Im Laufe ihrer Entwicklung differenzieren sich diese
Zellen zu verschiedenen Geweben aus, die jeweils eine spezielle lebenserhaltende Aufgabe
erfüllen. Wie jeder Produktionsprozess ist auch die Neubildung von Körpergeweben
fehleranfällig, Fehlregulationen des Zellwachstums können zu einer unkontrollierten
Gewebevermehrung im Körper führen, die wir als „Tumor“ bezeichnen. Tumore sind nicht
per se gefährlich, eine Bedrohung für die Funktionsfähigkeit des Organismus entsteht erst
dann, wenn sie entarten und es somit zu einer nachhaltigen Störung des genetisch
geregelten Gleichgewichts zwischen Zellzyklus, also Wachstum und Teilung, und
kontrolliertem Zelltod, der Apoptose, kommt. Man kann die Ursache dieser fehlgesteuerten
Entwicklung letzlich auf eine einzelne Zelle zurückführen, deren Signal zur Zellteilung sich
nicht mehr abschalten lässt und die diese Eigenschaft auf ihre Tochterzellen weitervererbt.
Da das Signal zur Initialisierung des Zellzyklus die Zellen von außen erreicht, handelt es sich
also letzlich um einen Fehler in der intrazellulären Verarbeitung eines externen Signals.
Dabei bindet ein extrazelluläres Signalmolekül entweder an einen membranständigen
Rezeptor einer Zelle, der das Signal weiter ins Zellinnere vermittelt, oder es diffundiert direkt
durch die Plasmamembran, um eine zelluläre Reaktion auszulösen. Die verschiedensten
Organismen bedienen sich bei der Informationsübertragung, der sogenannten Signal-
transduktion, Signalwege, die sich trotz zum Teil unterschiedlichster Aufgaben sehr ähnlich
sind. Ein in der Biologie häufig beschriebenes Prinzip der intrazellulären Signalweiterleitung
ist die Signalübertragung durch sogenannte G-Proteine. Neben den trimeren G-Proteinen
spielen hier die kleinen GTPasen eine zentrale Rolle, die über ein gebundenes
Guaninnukleotid in der Lage sind, als molekulare Schalter zu wirken. In ihrem aktivierten,
GTP-gebundenen Zustand können diese Proteine mit den Bindungsdomänen eines Effektor-
moleküls in Wechselwirkung treten. Die strukturellen Unterschiede solcher Effektormoleküle
bestimmen so den weiteren Verlauf des Signals in der Signalkaskade. Eine Vielzahl von
Signaltransduktionswegen, die auf dem Prinzip der Bindung von GTP (aktiver Zustand) oder
GNP (inaktiv) beruhen, werden von den sogenannten Ras-Proteinen reguliert. Eine
dauerhafte Aktivierung des Ras-Proteins aufgrund einer mutationsbedingten Fehlfunktion
kann zu Störungen in der Zellproliferation, Zelldifferenzierung und der Apoptose führen.
Aktiviertes Ras bindet an bestimmte Regionen eines Ras-spezifischen Effektorproteins, der
sogenannten Ras-Bindedomäne. Die gebundenen Effektoren erfahren durch die Bindung an
Ras eine Konformationsänderung, die entweder die an sie gebundenen Proteine aktiviert
oder deren Wechselwirkung mit anderen Molekülen fördert oder hemmt. Die kleine GTPase
Ras erschließt durch die Fähigkeit, verschiedene Effektoren zu binden, ein Netzwerk
6Einleitung
verschiedener Signalwege. Mutationen des Ras-Gens (z. B. im Codon 12, 13 oder 61)
[Bos89] führen zu einem nicht
hydrolysierbaren stets aktiven Ras-Protein, welches im Organismus molekulare
Erkrankungen wie z. B. Neurofibromatose [Wei99] oder Tumorwachstum auslöst [Bar87].
Ließe sich die Ras-vermittelte Signaltransduktion durch Inhibitormoleküle, die sich zwischen
die Interaktionsstellen von Ras und Effektor drängen, unterbinden, könnten Erkrankungen,
die auf einer fehlerhaften Signalweiterleitung durch Ras oder einen seiner Effektoren
beruhen, gelindert oder gar therapiert werden. Der Entwurf eines künstlich hergestellten
Inhibitormoleküls, bei dem es sich z. B. um ein Peptid handeln könnte, setzt die Kenntnis der
dreidimensionalen Struktur sowohl von Ras als auch die der Ras-Bindedomänen seiner
Effektoren in einer möglichst natürlichen Umgebung voraus. Bindungs- und Moleküldynamik-
studien geben detaillierte Hinweise über die Wechselwirkungen, die den Ras•Effektor–
Komplex stabilisieren.
Mit der hochauflösenden Flüssigkeitskernspinresonanz – Spektroskopie (NMR) existiert eine
Methode, die dreidimensionale Struktur eines Makromoleküls unter nahezu physiologischen
Bedingungen in atomarer Auflösung aufzuklären und zu untersuchen. Kennt man die
Zuordnung der