Novel concepts in biological plant protection on the basis of the biological control agent Serratia plymuthica HRO-C48 [Elektronische Ressource] = Neue Konzepte für den biologischen Pflanzenschutz am Beispiel des Biological-control-Agents Serratia plymuthica HRO-C48 / Henry Müller

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• Publié le: 01 janvier 2006
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Novel concepts in biological plant protection on the basis of the
biological control agent Serratia plymuthica HRO-C48

Neue Konzepte für den biologischen Pflanzenschutz am Beispiel des Biological Control
Agents Serratia plymuthica HRO-C48








Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.) der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Universität Rostock




Henry Müller
geb. am 17.08.1976
aus Rostock





Oktober, 2006


urn:nbn:de:gbv:28-diss2008-0119-6




















Gutachter:

Prof. Dr. Gabriele Berg
Technische Universität Graz
Institut für Umweltbiotechnologie
Petersgasse 12
A-8010 Graz

Prof. Dr. Hubert Bahl
Universität Rostock
Institut für Biowissenschaften Mikrobiologie
Albert-Einstein-Straße 3
D-18059 Rostock



IIAbstract
For ecological and economical reasons the management of soil-borne diseases in agriculture by conventional
pesticides is limited. Environmentally friendly alternatives such as the employment of microbial antagonists to
control phytopathogens are of growing interest. Inconsistent performance of the microorganisms, however, has
hampered commercial application of biological control agents (BCAs). One of the main problems is to achieve
an active and stable colonization of the plant root by the introduced microorganism.

The results of the present work revealed the special significance of adequate cell densities for the efficiency of
the biological control agent Serratia plymuthica HRO-C48, which has already been successfully commercialized
®for strawberry cropping under the name of RHIZOSTAR . Constitutively produced and secreted N-acyl
homoserine lactones (AHLs) allow Gram-negative bacteria to monitor their own population density and to
coordinate the regulation of gene expression; a mechanism referred as quorum sensing. In S. plymuthica,
particularly, these signalling molecules are essentially involved in the suppression of Verticillium wilt in oilseed
rape. In vitro analyzes of two AHL-deficient derivates of HRO-C48 indicate the responsibility of AHLs for the
regulation of antagonistic traits including the excretion of the fungal cell-wall degrading chitinases and proteases
as well as the production of the antifungal compound pyrrolnitrin. Additionally, AHL-mediated control was
demonstrated for behaviours characteristic for the plant-microbe interaction such as the biosynthesis of indole-3-
acetic acid, biofilm formation and motility.

Growers of oilseed rape and olive trees are faced to severe yield losses caused by the Verticillium wilt; the
control of which by chemical measures is nearly impossible. The application of S. plymuthica to control
Verticillium-mediated premature ripeness of oilseed rape demands a seed inoculation technique which allows the
BCA to effectively establish on the developing root from the moment of germination. Using bio-priming, which
was newly developed in order to apply the BCA on oilseed rape seeds, HRO-C48 was located in the seed
interior. Situated within the seed, the deleterious impact from external influences on the bacterial cells is limited.
This advantage resulted in an enhanced shelf-life of the bacterial cells during the storage at 20°C. Bio-priming,
which is suitable for the integration into the seed production framework, was employed for experiments under
field conditions. Results confirmed the usability of the bio-priming procedure to support the establishment of the
antagonistic bacterium in the rhizosphere of oilseed rape.

Integrated management of Verticillium wilt in olive involves the delivery of pathogen-free planting material by
nurseries. The introduction of S. plymuthica to seven-month old olive trees by root dipping resulted in the
colonization of the olive root, disease suppression and enhanced plant growth over a period of five months.

The knowledge of the mode of action of bacterial antagonists and its regulatory backgrounds allows the
development of profound concepts for biological control. The AHL-based quorum sensing system of S.
plymuthica HRO-C48 is involved in the population density-dependent expression of beneficial traits. From the
practical point of view, the objective to obtain high cell densities of the BCA in the rhizosphere demands reliable
application procedures. Considering plant health and plant growth, the utilization of bio-priming to inoculated
oilseed rape seeds and the bacterial treatment of young olive plant by root dipping resulted in effective
population densities of HRO-C48.
iiiZusammenfassung
Die effiziente Bekämpfung bodenbürtiger Schadorganismen in der Landwirtschaft mit Hilfe von konventionellen
Agrochemikalien ist sowohl aus ökologischen, als auch aus ökonomischen Gründen limitiert. Die Nutzung des
Potenzials mikrobieller Antagonisten zur Kontrolle von Phytopathogenen stellt eine bedeutende und gleichzeitig
umweltfreundliche Alternative dar. Die derzeit geringe Akzeptanz biologischer Pflanzenschutzpräparate wird
mit der fehlenden Wirksicherheit begründet, die oftmals die Folge von zu geringen Populationsdichten des
applizierten Organismus an der zu schützenden Pflanze ist.

Mit der vorliegenden Arbeit konnte die Signifikanz adäquater Zellzahlen für die Wirksamkeit des Biological
®Control Agents (BCA) S. plymuthica HRO-C48, auf dessen Basis bereits das Präparat RHIZOSTAR zur
Abwehr von pathogenen Pilzen und Ertragsteigerung im Erdbeeranbau entwickelt wurde, belegt werden. Die
von HRO-C48 produzierten N-Acyl-Homoserinlaktone (AHLs), deren Konzentration in der Zelle und in dessen
Umgebung eine direkte Funktion der Zelldichte ist, sind bei der Suppression der Verticillium-Welke am Raps
von essentieller Bedeutung. AHLs fungieren als Autoinduktoren in bakteriellen Quorum sensing-Systemen und
sind in S. plymuthica sowohl in der Regulation antagonistischer Wirkmechanismen, als auch in der Steuerung
der Interaktion mit der Pflanze involviert. Die in vitro Analysen von zwei AHL-defekten Mutanten von HRO-
C48 belegen, dass die Signalmoleküle die Exkretion von extrazellulären Enzymen, die Synthese des
Antibiotikums Pyrrolnitrin sowie die Auxinproduktion, Biofilmbildung und Motilität beeinflussen.

Die Verticillium-Welke konfrontiert die Produzenten von Winterraps und Oliven mit steigenden Ernteausfällen
und fehlenden Bekämpfungsmöglichkeiten. Der Einsatz von S. plymuthica zur Schadensminimierung im
Pathosystem Winterraps-Verticillium longisporum erfordert eine Saatgutbehandlung, die den BCA befähigt, sich
mit Beginn der Wurzelentwicklung zu etablieren. Mit Hilfe der Methode des Bio-primings, die während dieser
Arbeit für die Applikation von HRO-C48 an den Rapssamen entwickelt wurde, war es möglich, das Inokulum
direkt im Inneren des Saatkorns zu positionieren. Der daraus resultierende Schutz vor äußerlichen Einwirkungen
wirkte sich signifikant positiv auf die Lagerstabilität der Zellen bei 20 °C aus. Das Bio-priming, welches sich
potenziell großtechnisch realisieren lässt, kam im Rahmen eines Feldversuches zum Einsatz, mit dem die
Eignung dieser Inokulationsprozedur für eine stabile Etablierung des antagonistischen Bakteriums an der
Rapswurzel validiert wurde.

Im Rahmen einer integrierten Bekämpfung der Verticillium-Welke im Olivenanbau ist die pathogenfreie
Vermehrung von Pflanzenmaterial von primärer Bedeutung. S. plymuthica HRO-C48, appliziert durch ein
Wurzeltauchbad, besiedelte die Olivenwurzel und zeigte sowohl eine Hemmwirkung auf das Pathogen als auch
eine Pflanzenwachstumsförderung an vier Monate alten Olivenbäumen über einen Zeitraum von fünf Monaten.

Das Wissen über die Wirkmechanismen von bakteriellen Antagonisten und dessen Regulation erlaubt eine
gezielte Entwicklung neuer Konzepte für den biologischen Pflanzenschutz. Ein auf AHL-Moleküle basierendes
Quorum sensing-System koordiniert die Expression nützlicher Eigenschaften in S. plymuthica HRO-C48 in
Abhängigkeit von der Zelldichte. Eine wesentliche technische Vorraussetzung für das Erreichen hoher
Zellzahlen des BCAs in der Rhizosphäre ist eine geeignete Applikationsprozedur. Hinsichtlich der
Pflanzengesundheit und des Pflanzenwachstums resultierte die für die Inokulation von Rapssamen entwickelte
Methode des Bio-primings sowie die Behandlung von jungen Olivenpflanzen mit der Wurzeltauchbadtechnik in
eine wirksame Populationsdichte von S. plymuthica HRO-C48.
iiiTable of contents
Abstract iii
Zusammenfassung iii
Table of contents iv
Abbreviations viii
1 Introduction 1
2 Material and Methods 9
2.1 Sources of supply 9
2.2 Organisms and culture conditions 9
2.3 Media 11
2.3.1 Bacterial growth media 11
2.3.2 Fungal growth media 14
2.4 DNA manipulations 15
2.4.1 Extraction of genomic DNA from bacteria 15
2.4.2 Plasmi