On the enzymatic mechanism of 2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase from Clostridium difficile [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Jihoe Kim

Jihoe

Description

On the enzymatic mechanism of 2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase from Clostridium difficile Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) dem Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg vorgelegt von Jihoe Kim aus Korea Marburg/Lahn 2004 Die Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit wurden von Oktober 2001 bis November 2004 am Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. W. Buckel durchgeführt. Vom Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg als Dissertation am _______________ angenommen. Erstgutachter: Prof. Dr. W. Buckel Zweitgutachter: Prof. Dr. R. Thauer Tag der mündlichen Prüfung: _______________ Die im zeitlichen Rahmen dieser Dissertation erzielten Ergebnisse sind in folgenden Publikationen veröffentlicht: Kim, J., Hetzel, M., Boiangiu, C. D. & Buckel, W. (2004) Dehydration of (R)-2-hydroxyacyl-CoA to enoyl-CoA in the fermentation of α-amino acids by anaerobic bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 28, 455-468. Buckel, W., Hetzel, M. & Kim, J. (2004) ATP-driven electron transfer in enzymatic radical reactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 462-467 Kim, J., Darley, D. & Buckel, W. (2004) 2-Hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase and its activator from Clostridium difficile, Euro. J. Biochem. in press.

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• Biologie

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• Publié le: 01 janvier 2004
• Nombre de lectures: 32
• Langue: Deutsch
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Extrait

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On the enzymatic mechanism of

2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase

fromClostridium difficile 

   Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

  dem Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marbu vorgelegt von    Jihoe Kim aus Korea       Marburg/Lahn 2004

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Die Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit wurden von Oktober 2001 bis November 2004

am Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg unter der Leitung von Herrn Prof.

Dr. W. Buckel durchgeführt.

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Vom Fachbereich Biologie

der Philipps-Universität Marburg als Dissertation am _______________ angenommen.

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Erstgutachter:

Zweitgutachter:

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Prof. Dr. W. Buckel

Prof. Dr. R. Thauer

Tag der mündlichen Prüf g: _______________ un

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Die im zeitlichen Rahmen dieser Dissertation erzielten Ergebnisse sind in folgenden

Publikationen veröffentlicht:





Kim, J., Hetzel, M., Boiangiu, C. D. & Buckel, W. (2004) Dehydration of (R-)xordyh-2l-cyya

CoA to enoyl-CoA in the fermentation ofα-amino acids by anaerobic bacteria.FEMS

Microbiol. Rev. 28, 455-468.



Buckel, W., Hetzel, M. & Kim, J. (2004) ATP-driven electron transfer in enzymatic radical

reactions.Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 462-467



Kim, J., Darley, D. & Buckel, W. (2004) 2-Hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase and its

activator fromClostridium difficile,Euro. J. Biochem.in press.

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Contents

Contents

- 1 -

 Abbreviations.......................................................................................................4 

Zusammenfassung ............................................................................................... 5 

Summary .............................................................................................................. 6 

Introduction ......................................................................................................... 7 

1. Fermentation of amino acids by clostridia ..................................................................... 7

2. Radicals in enzymatic processes .................................................................................... 9

3. Dehydration of (R)-2-hydroxy acids: 2-hydroxyacyl-CoA dehydratase...................... 10

4. Fermentation of leucine byClostridiumdifficile......................................................... 15

5. Goals of the work ......................................................................................................... 17

Materials and Methods ..................................................................................... 18 

1. Materials....................................................................................................................... 18

1.1. Chemicals and reagents ........................................................................................ 18

1.1.1. (R)- and (S)-2-Hydroxyisocaproate .............................................................. 18

1.1.2. (E)-2-Isocaprenoate (4-methyl-trans-2-pentenoate) .................................... 18

1.1.3.

1.1.4.

1.1.5.

1.1.6.

1.1.7.

1.2.

1.3.

1.4.

2-Hydroxyisocaproyl-CoA........................................................................... 18 (R2-H-)xy[2ydro- 2 H 1 ]isocaproate ................................................................ 19 (RyHrdxo[y-)-23- 2 H 2 ]isocaproate ................................................................ 19 (R-2)H-dyoryx2[3,- 2 H 3 ]isocaproate ............................................................. 19 (Rroxy-Hyd)-21[- 13 C]isocaproate ................................................................ 19

Instruments and columns...................................................................................... 20

Anaerobic work .................................................................................................... 20

Bacteria and culture media ................................................................................... 20

1.4.1.Clostridium difficile...................................................................................... 20

1.4.2.Escherichia coli............................................................................................ 22

1.5. Plasmids ............................................................................................................... 22

1.6.

Antibiotics ............................................................................................................ 22

2.MethodsforDNAwork...............................................................................................23

2.1.

2.2.

2.3.

2.4.

2.5.

Plasmid DNA isolation......................................................................................... 23

Genomic DNA isolation fromC.difficile............................................................ 23

Agarose gel electrophoresis ................................................................................. 24

Elution of DNA fragments from agarose gel ....................................................... 24

DNA restriction and ligation ................................................................................ 24

Dialysis of ligation mixtures ................................................................................ 24

2.6.

2.7.

Electrotransformation........................................................................................... 25

- 2 -

Preparation of competentE.coli 24cells for electrotransformation.........................

2.9.

PCR reactions ................................................................................................... 25

2.8.

DNA concentration and purity determination ...................................................... 25

2.11.

Cloning of the genes......................................................................................... 26

2.10.

PCR primers ..................................................................................................... 26

3.5.

Non-heme iron determination .............................................................................. 32

3.6.

Acid-labile sulfur determination .......................................................................... 33

3.4.3.

3.4.4. (R 31)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase ................................................

3.4.5. NADH:ferredoxin oxidoreductase ............................................................... 32

Determination of protein concentration ............................................................... 32

3.9.

Separation of activated dehydratase from activator ......................................... 34

3.10.

Complex of dehydratase and activator; formation and purification................. 35

3.7.

Iodometric determination of the sulfide standard ................................................ 34

3.8.

Flavindetermination............................................................................................34

3.1.

Gene expressions and protein purification ........................................................... 28

3.2.

Purification of (R ................................. 29)-2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase

Sequencing of the cloned genes ....................................................................... 27

2.12.

3. Methods for protein work............................................................................................. 28

2.13.

(E 30)-2-Isocaprenoyl-CoA:2-hydroxyisocaproate CoA transferase................

3.4.1. (R)-2-Hydroxyisocaproate dehydrogenase................................................... 30

ATPase activity of activator ......................................................................... 31

3.4.2.

3.3.

Preparation of soluble membrane protein ............................................................ 29

3.4.

Enzyme activity assays......................................................................................... 30

2.1.

Analysis ofldhA................................................................................................... 38

2. (R 38)-2-Hydroxyisocaproate dehydrogenase...................................................................

1. Putative gene cluster for the reduction of leucine byC. difficile................................. 37

Results.................................................................................................................37 

3.12.

Protein molecular mass determination ............................................................. 36

3.11.

3.1.

Analysis ofhadA.................................................................................................. 41

Contents

3. (E 41)-2-Isocaprenoyl-CoA:2-hydroxyisocaproate CoA-transferase ...............................

2.3.

Substrate specificity ............................................................................................. 40

2.2.

Cloning and expression ofldhAand protein purification .................................... 38

Contents

3.2.

3.3.

- 3 -

Cloning and expression ofhadA 41and protein purification....................................

Properties.............................................................................................................. 41

3.4. Inactivation by NaBH 4 or hydroxylamine............................................................ 45 4. Activator of (R 45)-2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase.............................................

4.1. Analysis ofhadI................................................................................................... 45

4.2 Cloning and expression ofhadIand protein purification..................................... 47

4.3. UV-vis spectra and ATPase activity .................................................................... 47

5. (R 49)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase ................................................................

5.1. Analysis ofhadBC............................................................................................... 49

5.2. Cloning and expression ofhadBC ................................. 49and protein purification

6. Dehydratase purification fromC. difficile.................................................................... 51

7. Direct continuous activity assay................................................................................... 52

8. Catalytic activation of the dehydratase by its activator................................................ 53

9. Electron recycling: separation of the activated dehydratase from its activator............ 54

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

Metronidazole effect ................................................................................................ 56

UV-vis spectrum of cofactor supernatant................................................................. 57

Metal analysis........................................................................................................... 57

Complex of activator and dehydratase ..................................................................... 59

Detection of a substrate-derived organic radical by EPR spectroscopy................... 61

Deuterium kinetic isotope effects............................................................................. 64

Preliminary stereochemistry..................................................................................... 64

Discussion ........................................................................................................... 65 

1.

2.

3.

4.

5.

(R 65)-2-Hydroxyisocaproate dehydrogenase...................................................................

(E)-2-Isocaprenoyl-CoA:2-hydroxyisocaproate CoA transferase................................ 66

Activator....................................................................................................................... 68

(R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase ................................................................ 69

Outlook......................................................................................................................... 73

References..........................................................................................................74 



Abbreviations

Abbreviations  DTT EPR FPLC FMN FAD Maldi-TOF MS

Mops OD SDS TEMED TCA Tris UV-vis 

 

   

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   

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- 4 -

Dithiothreitol Electron Paramagnetic Resonance Fast Protein Liquid Chromatography Riboflavin-5'-phosphate Flavin Adenine Dinucleotide Matrix-assisted laser desorption ionisation - time of

flight mass spectrometry 4-Morpholinepropanesulfonic acid Optical Density

Sodium dodecylsulfate N,N,N',N'-trTethaeetylelyhidennimae Trichloroacetic acid 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol Ultraviolet visible

Zusammenfassung

Zusammenfassung

 5 - -

 Die GeneldhA undhadA ausClostridium difficile 1296 (DSMZ T ) wurden kloniert und in

Escherichia coli Die erhaltenen Proteine wurden gereinigt und als exprimiert. D -2- Hydroxyisocaproat-Dehydrogenase (LdhA) und 2-Hydroxyisocaproat-CoA-Transferase

(HadA) identifiziert. Die Enzyme katalysieren zwei Schritte in der Fermentation von Leucin zu Ammonium, CO 2 , Isovalerat und Isocaproat. Die nächsten im Genom vonC. difficile liegenden GenehadBC undhadI ebenfalls aktiv exprimiert und als 2- wurden

Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase (HadBC) und ihrem Aktivator (HadI) identifiziert. Die

Dehydratase katalysiert die Eliminierung von Wasser aus (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA zu

Isocaprenoyl-CoA, die eine chemisch schwierige Reaktion darstellt, da das Proton in derβ- Position nicht aktiviert ist (pKca. 40). Wir postulieren, dass erst die Reduktion des Substrats

mit einem Elektron die Eliminierung ermöglicht, wobei der pK bis 14 gesenkt mindestens

wird. Anschließend wird das Elektron wieder ans Enzym zurückgegeben.

Die heterodimere Dehydratase und der homodimere Aktivator sind Eisen-Schwefel-

Proteine, in denen keine weiteren prosthetischen Gruppen (oder Metalle wie Molybdän)

detektiert werden konnten. Der durch Ferredoxin reduzierte Aktivator überträgt unter ATP-

Hydrolyse ein Elektron auf die Dehydratase, die dadurch in den katalytisch aktiven Zustand

überführt wird. Dieser ATP-getriebene Elektronen-Transfer ähnelt dem der Nitrogenase. Die

aktivierte und vom Aktivator abgetrennte Dehydratase katalysiert ca. 10000 Umsätze bis das

Elektron durch Oxidation verloren geht. Durch anschließende Zugabe von ATP und Aktivator

kann die inaktivierte Dehydratase wieder voll aktiviert werden. Die Bildung eines stabilen aktiven AlF 4- -induzierten Komplexes aus Dehydratase und Aktivator stützt den postulierten Elektronentransport vom Aktivator zur Dehydratase und zeigt ebenfalls die Rückgewinnung

des benötigten Elektrons nach jedem Turnover. In Übereinstimmung damit werden zur

maximalen Aktivität nur substöchiometrische Mengen an Aktivator (Aktivator/Dehydratase = 

1:10) benötigt. Mit Hilfe der EPR-Spektroskopie wurde zum ersten Mal während der

Dehydratisierung eines 2-Hydroxyacyl-CoA-Derivats ein organisches Radikalsignal

detektiert. Mit Hilfe von isotopmarkierten Substraten veränderten sich die EPR-Spektren in

einer für das Ketylradikalanion des Isocaprenoyl-CoA charakteristischen Weise.

