On the influence of feedstock properties and composition on process development of expanded bed adsorption [Elektronische Ressource] = Einfluss der Eigenschaften und Zusammensetzung biotechnologischer Rohlösungen auf die Prozessentwicklung im Rahmen der Fließbettadsorption / vorgelegt von Peter Jochen Brixius

Peter Brixius

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• Publié le: 01 janvier 2003
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• Langue: Deutsch
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Extrait

INSTITUTE OF ENZYMETECHNOLOGY PROTEIN PURIFICATION DEPARTMENT
HEINRICH HEINE UNIVERSITY NOVO NORDISK A/S
DÜSSELDORF/GERMANY GENNTOFTE / DENMARK
On the influence of feedstock properties and composition on process
development of expanded bed adsorption
Einfluss der Eigenschaften und Zusammensetzung biotechnologischer Rohlösungen auf die
Prozessentwicklung im Rahmen der Fließbettadsorption
I n a u g u r a l - D i s s e r t a t i o n
zur
Erlangung des Doktorgrades der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
Der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
Vorgelegt von
Diplom Biologe Peter Jochen Brixius
aus Köln
2003Gedruckt mit der Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
Referentin: Prof. Dr. Maria Regina Kula
Korreferent: Prof. Hanns Weiss
Tag(e) der mündlichen Prüfung: 03.06.2003DANKSAGUNG
DANKSAGUNG
Diese Arbeit entstand am Institut für Enzymtechnologie der Heinrich Heine Universität
Düsseldorf im Forschungszentrum Jülich unter der Leitung von Frau Prof. Dr. Maria Regina
Kula.
Frau Prof. Dr. Kula gilt mein besonderer Dank für die freundliche Aufnahme in ihrem Institut,
die Überlassung des Promotionsthemas sowie der stetigen Diskussionsbereitschaft und
fachkundigen Unterstützung. Herr Prof. Dr. Weiss gilt mein Dank für die Übernahme des
Korreferates.
Ein besonderer Dank geht auch an die Firma Novo Nordisk und hier insbesondere an Frau Inger
Mollerup, Herr Ole E. Jensen, Herr Jesper S. Johansen, Herr Henrik Valore sowie an alle
anderen Mitarbeitern des Protein Purifikation Department sowie des hgH Projects &
Optimisation Departments für eine hervorragende Kooperation in den letzten drei Jahren sowie
für die freundlich Aufnahme und Unterstützung während meiner Arbeiten in den Labors von
Novo Nordisk Gentofte (Dänemark) und nicht zuletzt auch danke für die finanzielle und
materielle Unterstützung die diese Arbeit erst ermöglicht hat.
Ganz herzlich danken möchte ich mich auch der Arbeitsgruppe „Aufarbeitung“ unter der Leitung
von Herrn Priv.-Doz. Dr. Jörg Thömmes und seit Januar 2001 Herrn Dr. Jürgen J. Hubbuch für
eine stets angenehme und fruchtbare Arbeitsatmosphäre. Besonders erwähnt seien hier Markus
Halfar für seine praktische Unterstützung sowie Dipl. Ing. Esther Knieps-Grünhagen, Dipl. Ing.
Holger Gieren, Dr. Ute Reichert und Dr. Dong-Qiang Lin. Desweiteren möchte ich mich bei
Sina Paezold bedanken die als studentische Hilfskraft diese Arbeit tatkräftig unterstützt hat.
Außerdem gilt mein Dank allen Mitarbeitern des Instituts für Enzymtechnologie die hier noch
nicht erwähnt worden sind.1 CONTENT I
1 CONTENT
1 CONTENT .............................................................................................. I
2 FIGURES AND TABLES ...................................................................... V
3 ABSTRACT (GERMAN) ....................................................................... 1
4 SYMBOLS & ABBREVIATIONS........................................................... 4
5 INTRODUCTION................................................................................... 9
5.1 Downstream Processing 9
5.1.1 Extractive Separation.................................................................................. 12
5.1.2 Adsorptive Separations............................................................................... 12
5.1.3 Stable fluidization....................................................................................... 13
5.1.4 Chromatographic interactions..................................................................... 17
5.1.5 Ion Exchange Chromatography in Expanded Bed Adsorption................... 20
5.2 Biomass-Adsorbent Interactions ................................................................... 23
5.2.1 Quantification of biomass/adsorbent interaction ........................................ 23
5.2.2 Deep bed filtration theory – A mechanistic approach ................................ 26
5.3 Properties of biomass suspension.................................................................. 30
5.3.1 Particle size analysis ................................................................................... 30
5.3.2 Zeta Potential .............................................................................................. 32
5.4 Microbial cell wall properties........................................................................ 35
5.4.1 E. coli.......................................................................................................... 36
5.4.2 Saccharomyces cerevisiae .......................................................................... 39
5.5 Cell disruption................................................................................................. 40
5.5.1 Sonication ................................................................................................... 41CONTENT
5.5.2 Bead mill..................................................................................................... 42
5.5.3 High pressur Homogenization .................................................................... 44
5.6 Protein properities used in process design studies ...................................... 46
5.6.1 Insulin ......................................................................................................... 46
5.6.2 Human Growth Hormone (hGH)................................................................ 48
5.6.3 Formate dehydrogenase .............................................................................. 49
6 RESULTS AND DISCUSSION............................................................ 52
6.1 Feedstock properties & Biomass-Adsorbent Interactions in Expanded Bed
Adsorption....................................................................................................... 52
6.1.1 Zeta potential development of intact cells during high cell density
cultivation of Escherichia coli.................................................................................... 53
6.1.2 Impact of cell disruption on feedstock properties....................................... 57
6.1.3 Escherichia coli host strains........................................................................ 75
6.1.4 Scalability and feasibility study.................................................................. 77
6.1.5 Saccharomyces cerevisiae........................................................................... 83
6.1.6 Summary and Conclusions I....................................................................... 87
6.2 EBA & Downstream Process development .................................................. 89
6.2.1 Insulin ......................................................................................................... 89
6.2.2 Summary and Conclusions II (Insulin Precursor MI3)............................. 102
6.2.3 Human Growth Hormone (hGH)............................................................. 104
6.2.4 Anion Exchange Chromatography (EBA-mode)...................................... 105
6.2.5 Cation Exchangegraphy (EBA-mode) ..................................... 115
6.3 Aqueous two phase systems ......................................................................... 124
6.3.2 Summary and Conclusions III (hGH)....................................................... 130
7 MATERIAL & METHODS ................................................................. 132
7.1 Protein Analysis ............................................................................................ 139
7.1.1 Total Protein Determination (Bradford Assay)......................................... 139
7.1.2 SDS Page .................................................................................................. 140CONTENT
7.1.3 RP-HPLC-Analysis for Insulin Precursor MI3......................................... 140
7.1.4 FPLC-Analysis for hGH ........................................................................... 144
7.2 Protein Adsorption ....................................................................................... 149
7.2.1 Finite bath uptake experiments................................................................. 149
7.2.2 Breakthrough Analysis ............................................................................. 153
7.2.3 Modeling of Breakthrough Curves in Packed Beds.................................. 156
7.3 Biomass-Adsorbent Interactions 161
7.3.1 Pulse-Response Experiment ..................................................................... 161
7.3.2 Residence Time Distribution (RTD) (Fernández-Lahore et al., 2001)..... 163
7.4 Protein adsorption in expanded bed mode................................................. 165
7.4.1 Human insulin precursor mi 3 .................................................................. 165
7.5 Cell cultivation .............................................................................................. 166
7.5.1 Saccharomyces cerevisiae......................................................................... 166
7.5.2 E. coli........................................................................................................ 167
7.6 Cell disruption......................