Phosphoproteomic analysis of craterostigma plantagineum upon abscisic acid and desiccation stress [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Fabio Facchinelli

Fabio Facchinelli

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• Publié par: rheinische_friedrich-wilhelms-universitat_bonn
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 8
• Langue: English
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Extrait

Phosphoproteomic Analysis of
Craterostigma plantagineum upon
Abscisic Acid and Desiccation Stress
Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.)
der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der
Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
vorgelegt von
Fabio Facchinelli
aus Bozen, Italien
Bonn 2009Angefertigt mit Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
1. Gutachter: Prof. Dr. Dorothea Bartels
2. Prof. Dr. Peter Dörmann
Tag der Promotion: 15. März 2010
Erscheinungsjahr: 2010I
Contents
Abbreviations VI
List of Figures XI
List of Tables XII
1. Introduction 1
1.1. The Importance of Water for Plant Survival . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2. The Importance of Water in Agriculture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.3. Mechanisms of Adaptation to Water Deficit . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.4. Origins and Evolution of Desiccation Tolerance . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.5. Desiccation Tolerance in Flowering Plants . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.5.1. Craterostigma plantagineum as Experimental System to Study the
Desiccation Tolerance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.5.2. The Linderniaceae Family . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.6. The Role of Abscisic Acid in the Response to Water Stress . . . . . . . . . 7
1.6.1. Reversible Protein Phosphorylation in ABA Signalling . . . . . . . 8
1.7. Synthesis of Protective Molecules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.7.1. Accumulation of Protective Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.8. The Importance of Protein Phosphorylation in Desiccation Stress Response 18
1.8.1. Methods for the Identification of Phosphoproteins . . . . . . . . . 19
1.9. Aims of this Study . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2. Materials and Methods 23
2.1. Plant Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.1.1. Growth Conditions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.1.2. Plant Stress Treatments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23Contents II
2.2. Bacterial Strains . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.2.1. Growth of Microorganisms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.2.2. Glycerol Stocks . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3. Phages and Vectors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.4. Chemicals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.5. Enzymes and Markers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.6. Membranes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.7. Kits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.8. Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.9. Databases and Softwares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.10.Media . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.10.1. Supplements for Media . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.11.Primers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.12.Scanning Electron Microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.13.Extraction of Nucleic Acids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.13.1. Extraction of RNA from Plant Tissue . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.13.2. of Plasmid DNA from Escherichia coli . . . . . . . . . . 32
2.13.3. Purification of DNA Fragments from Agarose Gels . . . . . . . . . 32
2.13.4. Precipitation of DNA with Phenol-Chloroform-Isoamylalcohol (PCI) 33
2.13.5. Estimation of Nucleic Acids Concentration . . . . . . . . . . . . . 33
2.14.Electrophoresis of Nucleic Acids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.15.Cloning Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.15.1. Primer Design . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.15.2. Synthesis of cDNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.15.3. Polymerase Chain Reaction (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.15.4. PEG Precipitation and Cloning into pJET1.2 . . . . . . . . . . . . 36
2.15.5. Restriction Digestion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.15.6. Ligation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.15.7. Transformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
® ®
2.16.In Vivo Mass Excision of the pBluescript Phagemid from the Uni–ZAP
XR Vector . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.16.1. Titration of the Phage Library . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
®
2.16.2. In Vivo Mass Excision of the pBluescript Phagemid . . . . . . . 39Contents III
2.17.Extraction of Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.17.1. Extraction of Total Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.17.2. Enrichment of Phosphoproteins from Denatured Proteins . . . . . . 42
2.17.3. ofeptides from Isolated Proteins . . . . . . . 43
2.17.4. Estimation of Proteins Concentration . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.18.Electrophoresis of Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.18.1. Isoelectrofocusing (First Dimension) . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.18.2. SDS–PAGE (Second . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.18.3. Staining of Polyacrylamide Gels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
2.19.Immunological Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.19.1. Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.19.2. Immunoprecipitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.20.Phosphatase Shift Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.21.Overexpression and Isolation of a Recombinant Protein . . . . . . . . . . . 51
2.22.Antibody Production . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.23.Production of a HiTrap NHS Column Coupled with a Protein . . . . . . . 53
2.23.1. Coupling the Protein to the Column . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
2.23.2. Measuring the Coupling Efficiency . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
2.24.Isolation of IgGs from Serum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
2.25.Identification of CDeT11–24 Interaction Partners . . . . . . . . . . . . . . 56
2.25.1. Coimmunoaffinity Chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.25.2. Weak Affinity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
2.26.Mass Spectrometry Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
3. Results 60
3.1. Desiccation Tolerance within the Linderniaceae . . . . . . . . . . . . . . . 60
3.1.1. Lindernia brevidens Is Desiccation Tolerant . . . . . . . . . . . . . 60
3.2. Analysis of the CDeT11–24 Protein and its Homologues from Lindernia
Species . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
3.2.1. Isolation of CDeT11–24 Homologues from Lindernia Species . . . . 64
3.2.2. Amino Acid Composition and Secondary Structure Features . . . . 71Contents IV
3.3. Production of an Antibody against CDeT11-24 . . . . . . . . . . . . . . . 75
3.3.1. Amplification and Cloning of CDeT11–24 into pET28-a Expression
Vector . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
3.3.2. Protein Isolation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
3.3.3. Antibody Production . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
3.4. Analysis of the Phosphorylation Status of the 11–24 Proteins . . . . . . . 79
3.4.1. Immunoprecipitation of the 11–24 Proteins . . . . . . . . . . . . . 79
3.4.2. Phosphatase Shift Assay of Lindernia 11–24 . . . . . . . . . . . . 84
3.4.3. Phosphorylation Sites Identification . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
3.5. Identification of CDeT11–24 Interaction Partners . . . . . . . . . . . . . . 99
3.5.1. Coimmunoaffinity Chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
3.5.2. Weak Affinity Chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
3.6. Comparison of Craterostigma plantagineum Callus Phosphoproteins upon
ABA and Dehydration Stress . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
3.6.1. UseofCraterostigmaplantagineum CallusSystemtoIdentifyChanges
in the Phosphoproteome . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
3.6.2. Phosphoprotein Enrichment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
3.6.3. 2D SDS–PAGE Separation of the Enriched Phosphoproteins and
Spot Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
4. Discussion 126
4.1. Distribution of the Desiccation Tolerance within the Linderniaceae . . . . . 126
4.1.1. L. brevidens and L. subracemosa Display Different Phenotypes Re-
garding Desiccation Tolerance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
4.2. Analysis of the 11–24 Protein Sequences . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
4.2.1. The 11–24 Homologues from L. brevidens and L. subracemosa Are
LEA-like Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
4.2.2. The 11–24 Homologues from L. brevidens and L. subracemosa
Share Sequence Features Common to Other Stress Responsive Pro-
teins . . . . . . . . .