Polluants environnementaux et développement du testicule foetal humain : effets et mécanismes des phtalates., Environmental pollutants and human fetal testis development : phthalates effects and mechanisms of action.
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Polluants environnementaux et développement du testicule foetal humain : effets et mécanismes des phtalates., Environmental pollutants and human fetal testis development : phthalates effects and mechanisms of action.

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Description

Sous la direction de Virginie Rouiller-fabre
Thèse soutenue le 11 avril 2011: Paris 11
Au cours des dernières décennies, nous avons progressivement vu augmenter un certain nombre d’anomalies de la fonction de reproduction masculine dans les pays industrialisés. Ces constatations ont fait émerger l’hypothèse selon laquelle certains polluants de notre environnement pourraient altérer le développement du testicule fœtal et ainsi être responsables de ces anomalies. Parmi les composants incriminés se trouvent les phtalates, largement répandus dans l’environnement. Ces composés ont été décrits comme reprotoxiques, ils altèrent le développement de la lignée germinale dans différentes espèces et entraînent une diminution de la production de testostérone chez le rat. Toutefois, très peu de données sont disponibles quant à leurs effets chez l’Homme. Dans cette étude, nous avons analysé les effets d’un phtalate, le MEHP, sur le développement du testicule fœtal humain au premier trimestre de la grossesse, dans un modèle de culture organotypique qui permet le maintien des différentes structures de l’organe. Nous avons tout d’abord démontré que le MEHP (10-4M) n’altère pas la production de testostérone du testicule fœtal humain, contrairement aux résultats décrits chez le rat. En revanche, nous avons montré que l’exposition au MEHP entraîne une rapide diminution du nombre de cellules germinales par apoptose. A la suite de ces résultats, nous avons testé l’effet de doses plus faibles de MEHP afin de se placer à des concentrations de phtalates ayant été mesurées dans les liquides biologiques. Nous avons ainsi démontré que les cellules germinales du testicule fœtal humain sont altérées suite à l’exposition à des doses de MEHP de 10-5M. Enfin, dans la 3ème partie de ce travail, nous nous sommes intéressés aux mécanismes d’action des phtalates. Différentes études, notamment dans le foie, démontrent l’implication des récepteurs nucléaires dans les effets de ces composés. Il nous a donc semblé important de rechercher leur implication dans les effets des phtalates sur le testicule fœtal. Nous avons démontré que LXRα est très certainement impliqué ces effets puisque l’expression des ARNm de ce récepteur est augmentée. Par ailleurs, ce récepteur nucléaire contrôle deux voies métaboliques, la synthèse de cholestérol et la synthèse des acides gras qui semblent toutes deux modulées par les phtalates dans le testicule fœtal humain. Enfin, nous avons montré que l’implication de ces voies métaboliques est commune entre la gonade mâle et la gonade femelle, sans pour autant que l’effet sur les cellules germinales mâles ai pu être mis en évidence dans l’ovaire fœtal. En conclusion, cette étude a contribué à caractériser les effets des phtalates sur la mise en place des fonctions de reproduction chez le fœtus humain. Nous avons également pu mettre en évidence un nouveau mécanisme de ces composés, impliquant la superfamille des récepteurs nucléaires ainsi que la synthèse du cholestérol et des acides gras.
-Phtalates
-Testicule fœtal humain
-Développement testiculaire
-Cellule germinale
Since the last decades, an increase in several abnormalities of the male reproductive function has been progressively evidenced in industrialized countries. According to these observations, it was hypothesized that exposure to some environmental pollutants may impair the fetal testis development, and therefore be at the origins of those abnormalities. Among incriminated compounds, phthalates are molecules highly produced worldwide. These compound are classified as reprotoxic molecules, as they disrupt the development of the germ cell lineage in different species and lead to a decrease in testosterone production in rat. Nevertheless, very few data are available concerning their effects in human. In this study we analyzed the effects of one phthalate, the MEHP, on the human fetal testis development during the first trimester of pregnancy. It was performed using an organotypic culture system that allows the preservation of the different testis structures. We first demonstrated that MEHP (10-4M) does not affect testosterone production of the human fetal testis, in opposition to the results described in rat. We also have demonstrated that MEHP exposure triggers apoptosis in the fetal germ cells, leading to a quick decrease in the total number of these cells. Following those results, we tested the effects of lower doses of MEHP that are close to the highest doses measured in human biological fluids. We therefore demonstrated that fetal germ cells are altered by exposure to this dose of MEHP (10-5M). Finally, in the third part of this work, we focused on the mechanisms of action of phthalate toxicity. Different studies, mostly in the liver, report the involvement of the nuclear receptor superfamilly in the effect of those compounds. Thus, it seemed important to investigate their implication in the effect of phthalates on the human fetal testis. We demonstrated that LXRα is certainly implicated in these effects as its transcriptional level is increased. Moreover, this nuclear receptor regulates two metabolic pathways: Cholesterol and fatty acid synthesis pathways, that seemed to by both modulated by phthalate exposure in the human fetal testis. We also showed that the modulation of these two metabolic pathways is a common process to both the male and female gonads. Nevertheless, the germ cell decrease we evidenced in the human fetal testis was never observable in the fetal ovary. In conclusion, this work contributed to improve our knowledge about the effects of phthalate exposure on the establishment and the development of the human fetal reproductive system. We also have evidenced a new mechanism of these compounds that involves members of the nuclear receptors superfamilly, as well as cholesterol and fatty acid synthesis.
-Phthalates
-Human fetal testis
-Testis development
-Germ cell
Source: http://www.theses.fr/2011PA11T011/document

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Informations

Publié par
Nombre de lectures 57
Langue Français
Poids de l'ouvrage 4 Mo

Exrait

UNIVERSITE PARIS-SUD 11
FACULTE DE MEDECINE
ED 419 BIO-SigNE


THESE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE PARIS 11
Spécialité : Biologie de la reproduction et du développement

Présentée et soutenue publiquement par

Vincent MUCZYNSKI

Le 11 Avril 2011

POLLUANTS ENVIRONNEMENTAUX ET DEVELOPPEMENT
DU TESTICULE FŒTAL HUMAIN : EFFETS ET MECANISMES
D’ACTION DES PHTALATES

Directeur de thèse : Pr. Virginie Rouiller-Fabre


JURY

Pr. Jacques YOUNG Président
Dr. David VOLLE Rapporteur
Dr. Christelle DELALANDE Rapporteur
Pr. Robert BAROUKI Examinateur
Pr. René FRYDMAN Examinateur
Pr. Virginie ROUILLER-FABRE Directeur de thèse
Pr. René HABERT Invité
tel-00631554, version 1 - 12 Oct 2011

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Je tiens à remercier sincèrement les membres de mon jury d’avoir bien voulus juger ce travail.

Je remercie notamment le Professeur Jacques Young d’avoir accepté la charge de
président du jury de cette thèse.

J’adresse également tous mes remerciements aux docteurs Christelle Delalande et
David Volle, pour avoir assumé la lourde tache d’être mes rapporteurs et de m’avoir fait part
de leur intérêt pour ce travail.

Enfin je tiens aussi à remercier les professeurs René Frydman et Robert Barouki
d’avoir accepté de participer à ce jury de thèse.

tel-00631554, version 1 - 12 Oct 2011

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TABLES DES MATIERES

AVANT-PROPOS..............................................................................................................................................2

ETATDEL’ART...............................................................................................................................................8
CHAPITREI. LEDEVELOPPEMENTDUTESTICULEFŒTALHUMAIN..............................10
I.Structureindifférenciée,lagonadebipotentielle.......................................................................................10
I.1.Formationdelacrêtegénitale......................................................................................10
I.2.MigrationdesCellulesGerminalesPrimordiales.................................................................................13
II.Déterminismegénétiquedeladifférenciationtesticulaire..................................15
II.1.SRYetl’originedeladifférenciationsexuelle......................................................................................15
II.2.Contrôlegénétiquecomplexedeladifférenciationtesticulaire..................15
III.Miseenplaceetcaractéristiquesdesdifférentstypescellulaires....................................................22
III.1.Lescellulessomatiquesdutesticule,supportdel’architecturetesticulaire........................22
III.1.1LescellulesdeSertoli...........................................................................................................................22
III.1.2LescellulesdeLeydig..........................................................26
III.1.3Cellulespéritubulairesmyoïdesetautrescellulesinterstitielles:..................................31
III.2.Lalignéegerminale........................................................................................................................................32
III.2.1Développementdescellulesgerminalesaucoursdelaviefœtale:.................................32
III.2.2Lesdifférentespopulationsdecellulesgerminalesetleursmarqueurs:......................................................34
III.2.3Facteursimpliquésdanslarégulationdunombredescellulesgerminalesfœtales:.............................39
IV.Méthodesd’étudedutesticulefœtalhumain............................................................................................42
IV.1.Lemodèledecultureorganotypique......................................................................42
IV.2.L’isolementdecellulesgerminales..........44
IV.2.1MicroDissectionLaser(MDL)...........................................................................................................................................44
IV.2.2Magnetic-ActivatedCellSorting(MACS).....................45
IV.2.3Fluorescence-ActivatedCellSorting(FACS)..............................................................................................................45
CHAPITREII. PERTURBATIONDUDEVELOPPEMENTTESTICULAIREFŒTAL................................................47
I.LeSyndromedeDysgénésieTesticulaire.......................................................................47
I.1.Donnéescliniques..............................................................................................................................................47
I.2.OriginefœtaleduTDS......................................49
I.2.1Hypospadiasetcryptorchidie.............................................................................................................50
I.2.2Réductiondelaproductionspermatique.......................................................50
I.2.3Cancertesticulaire....................................................................................................................................51
I.3.Etiologiedusyndromededysgénésietesticulaire..............................................52
I.3.1Originegénétique.....................................................................................................................................52
I.3.2Hypothèsedel’influencedefacteursenvironnementaux.......................................................................................53
II.LesPhtalates.............................................................................................................................................................55
II.1.Généralités...........................................................56

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II.1.1Métabolismedesphtalates..................................................................................................................................................57
II.1.2Concentrationsdephtalates...............60
II.1.2.1.Méthodesdemesure..................................................................................................................................................60
II.1.2.2.Niveauxdephtalatesdanslesfluidesbiologiques........................60
II.1.2.3.Potentielseffetsadditifs............................................................................................................................................62
II.2.Toxicitédesphtalatessurl’organisme....63
II.2.1Effetsdesphtalatessurlefoie...........................................................................................................................................63
II.2.2Effetsdesphtalatessurlathyroïdeetlesystèmeimmunitaire..........64
II.2.3Effetssurlafonctiondereproduction...........................................................................................................................65
II.2.3.1.Chezl’animal..................................................................65
a.Expositiondel’individuprépubèreetadulte........................................................................65
b.Expositionpendantlaviefœtaleetnéonatale.....................................67
II.2.3.2.Chezl’Homme................................................................................................................................................................73
a.Fonctiondereproductionchezlafemme...............................................................................................................73
b.Fonctiondereproductionchezl’Homme...............74
III.Mécanismesd’actiondesphtalates...............................................................................................................75
III.1.Mécanismesd’actioncellulairesdesphtalatesdansletesticule................75
III.1.1Mécanismesd’actiondesphtalatessurlescellulesdeLeydig...........................................................................75
III.1.2Mécanismesd’actiondesphtalatessurlescordonsséminifères.....77
III.2.Implicationdesrécepteursnucléairesdansleseffetsdesphtalates.......................................................................79
III.2.1Généralitésàproposdesrécepteursnucléaires......................................79
III.2.1.1.Structuremoléculaire...............................................................................................................79
III.2.1.2.Modesdefonctionnementdesrécepteursnucléaires................81
III.2.1.3.Classificationdesrécepteursnucléaires..........................................................................................................83
III.2.2Implicationdesrécepteursnucléairesdanslesmécanismesd’actionsliésauphtalates......................85
III.2.2.1.LavoiedesPPARs.................................................................................................................................85
III.2.2.2.Lavoiedesrécepteursauxhormonesstéroïdes...........................87
III.2.2.3.Lavoiedesautresrécepteursnucléaires.........................................................................................................89

MATERIELSETMETHODES......................................................................................................................92
I.Prélèvementdestesticulesfoetauxhumains:.............................94
II.Cultureorganotypique:.......................................................................................................................................95
II.1.Produitsetréactifsemployés:...................95
II.2.Méthodedeculture:.......................................................................................................................................................................96
III.Tridecellules:........................................................97
IV.Stratégiesd’analyse:...........................................................................................................98
IV.1.Histologie:.........................................................................................98
IV.1.1Préparationdeséchantillons............................................................................................................................................98
IV.1.2Immunohistochimie..............................................................................................................................................................99
IV.1.2.1.Comptagedescellulesgerminales....................100
IV.1.2.2.Quantificationdel’apoptoseetdelaprolifération.................................................................101
IV.2.Analysed’expressiondegène:...............................................................................101

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IV.2.1Extractiond’ARN..................................................................................................................................................................101
IV.2.2RealTimequantitativePCR(RTqPCR):....................101
IV.2.3PlaquesMicrofluidiques.:................................................................................................................................................103
IV.3.Analysesprotéiques:..................................................................................................................................................................103
IV.3.1Extractionetdosagedeprotéines:..............................103
IV.3.2Geld’électrophorèseetWesternBlot:.......................................................................................................................104
IV.3.3Immunodétectiondesprotéines-WesternMultiplex:......................105
IV.4.Dosageradioimmunologiquedelatestostérone:..........................................................................................................105
V.Statistiques:...........................................................................................106

RESULTATS.................................................................................................................................................108
ARTICLE1:....................................110
ARTICLE2:....................................................................................................................................113
ARTICLE3:....................................116

DISCUSSION................................................................................................................................................119
I.modèled’etude:lacutureorganotypiquedetesticulefœtalhumain...........................................122
II.Effetsdesphtalatesetmécanismesd’action............................................................................................123
III.Intégrationdenosdonnéesdanslecontextedespolluantsenvironnementaux....................131
IV.Perspectives..........................................................................................................................................................132

BIBLIOGRAPHIE........................................................................................................................................135

ANNEXES......................................................................................................................................................177
ARTICLECOMPLEMENTAIREN°1:............................179
ARTICLECOMPLEMENTAIREN°2:................................................................................................182
LISTEDESPUBLICATIONS:..........................................................................................................................................185


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TABLES DES ILLUSTRATIONS

Figure1:Différenciationdutractusgénitalhumainaucoursdelaviefœtale._________________________________11
Figure2:ParcoursmigratoiredesCGPslorsdudéveloppementembryonnaire._______________________________14
Figure3:Balancedelarégulationdudéterminismesexueldelagonadefœtale.______________________________21
Figure4:Formationdescordonsséminifèresaucoursdudéveloppement._____23
Figure5:EvolutiondunombredecellulesdeSertolihumainesaucoursdelaviefœtaleetpost-natale._____24
Figure6:EvolutiondunombredecellulesdeLeydigaucoursdelaviefœtaleetnéonatale.__________________27
Figure7:Variationsdesniveauxdetestostéronesériquependantlaviefœtaleetnéonatale. ________________28
Figure8:Fenêtredemasculinisationaucoursdudéveloppementfœtal._______________________________________29
Figure9:Evolutionaucoursdudéveloppement,desdifférentessouspopulationsdecellulesgerminales
fœtaleschezl’Homme.______________________________________________________________________________________________33
Figure10:Expression,chezl’Homme,desprincipauxantigènescaractéristiquesdescellulesgerminales
mâlesaucoursdelaviefœtale.____________________35
Figure11:Evolutiondesdifférentesanomaliesdelafonctiondereproductionmâlehumaine,aucoursdes
dernièresdécennies.________________________________________________________________________________________________48
Figure12:Hypothèsedel’originedusyndromededysgénésieTesticulaire(TDS)._____________________________49
Figure13:Formulesemidéveloppéedelastructuregénéraledesphtalates.__55
Figure14:Représentationschématiquegénéraledesmétabolisationsprimaireetsecondairedesdiester
phtaliquesàchainescarbonéeslongues.__________________________________________________________________________57
Figure15:ReprésentationschématiquedelamétabolisationprimaireduDi-2-EthylHexyl-Phtalate. _______59
Figure16:Structuregénéraledesrécepteursnucléaires.________________________________________________________80
Figure17:Modedefonctionnementgénéraldesrécepteursnucléairesséquestrésdanslecytoplasme.______81
Figure18:Modedefonctionnementgénéraldesrécepteursnucléairesséquestrésdanslenoyau.____________82

Tableau1:Synthèsedesprincipauxgènesimpliquésdanslamiseenplacedelagonadebipotentiellechez
l'Homme.____________________________________________________________________________________________________________12
Tableau2:Synthèsedesprincipauxgènesimpliquésdansladifférenciationtesticulairechezl'Homme. ____17
Tableau3:Synthèsedesprincipauxgènesimpliquésdansladifférenciationdel'ovairefœtalhumain.______19
Tableau4:Tableaurécapitulatifdesprincipauxantigènesexprimésparlesdifférentessouspopulationsde
cellulesgerminalesaucoursdelaviefœtalechezl'Homme._____________________________________________________37
Tableau5:RécapitulatifdestauxdeMEHPmesurésdanslesdifférentsfluidesbiologiquesdelafemme.____61
Tableau6:Effetsd’uneexpositionfœtaleauxphtalatessurlesfonctionstesticulairesnéonataleouadulteen
fonctiondel’espèce. ________________________________________________________________________________________________67
Tableau7:Effetsd’uneexpositionfœtaleauxphtalatessurlesdifférentstypescellulairesdutesticulefœtal
enfonctiondel’espèce._____________________________71
Tableau8:Nomenclatureetclassificationdesrécepteursnucléaireshumainsselonleurhomologiede
structure.____________________________________________________________________________________________________________84

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