Proteotoxicity of polyglutamine expansion proteins [Elektronische Ressource] : cellular mechanisms and their modulation by molecular chaperones / Christian Behrends

Christian Behrends

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• Publié par: ludwig-maximilians-universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2007
• Nombre de lectures: 24
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 9 Mo

Extrait

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Ludwig-Maximilians-Universität München





Proteotoxicity of polyglutamine expansion
proteins: Cellular mechanisms and their
modulation by molecular chaperones




Christian Behrends

aus

Frankfurt am Main



2006

Erklärung

Diese Dissertation wurde im Sinne von §13 Abs. 3 bzw. 4 der Promotionsordnung vom 29.
Januar 1998 von Prof. Dr. Franz-Ulrich Hartl betreut.





Ehrenwörtliche Versicherung

Diese Dissertation wurde selbstständig, ohne unerlaubte Hilfe erarbeitet.


München, den 4. Dezember 2006


Christian Behrends





Dissertation eingereicht am: 04.12.2006

1. Gutachter: Prof. Dr. Franz-Ulrich Hartl
2. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. Konstanze F. Winklhofer

Mündliche Prüfung am: 07.03.2007 Danksagung

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Oktober 2002 bis November 2006 am Max-
Planck-Institut für Biochemie, Martinsried, in der Abteilung Zelluläre Biochemie angefertigt.
An dieser Stelle möchte ich meinen Dank all jenen aussprechen, die zum Gelingen dieser
Arbeit beigetragen haben.
Mein besonderer Dank gilt dabei Prof. Dr. F. Ulrich Hartl für die interessante und reizvolle
Themenstellung, die großzügige Förderung und die hervorragenden Möglichkeiten, in seiner
Abteilung wissenschaftliches Denken und Arbeiten zu erlernen. Für hilfreiche Anregungen
und wertvolle Ratschläge danke ich auch Dr. Manajit Hayer-Hartl.
Dr. Konstanze F. Winklhofer danke ich ganz herzlich für konstruktive Diskussionen und die
Erstellung des Zweitgutachtens.
Ein besonderer Dank gilt Dr. Peter Breuer und Dr. Gregor Schaffar für die langjährige,
freundschaftliche und produktive Zusammenarbeit. Ihr Interesse, ihre Ideen und ihre
Diskussionsbereitschaft haben wesentlich zum Erfolg dieser Arbeit beigetragen. Dr. Katja
Siegers und Dr. Sarah Broadley danke ich für ihre Hilfsbereitschaft und Unterstützung sowie
viele wertvolle Anregungen. Dr. Raina Boteva und Carola Langer danke ich für die
hervorragende Zusammenarbeit. Dr. Jose Baral, Dr. Martin Vabulas, Dr. Jason Young und Dr.
Zoya Ignatova danke ich für viele inspirierende Diskussionen.
Weiterer Dank gilt allen momentanen und ehemaligen Mitarbeitern der Abteilung für die
freundschaftliche und hilfsbereite Atmosphäre, ohne die ein erfolgreiches Arbeiten nicht
möglich gewesen wäre. Insbesondere danke ich in diesem Zusammenhang Alice, Angela,
Christian, Chun, Iris, Jose, Juliane, Geli, Michael, Niclas, Sathish, Sophia, Shruti, Chi, Uli
und Ulrike. Tobi danke ich für die vielen erfrischenden Stunden im und außerhalb des Labors.
Zum Abschluss gilt mein besonderer Dank aber meiner Familie, die meine Arbeit
wohlwollend begleitet und mich in jeglicher Form unterstützt haben. Meinen Eltern, meiner
Schwester und meiner Großmutter Charlotte danke ich von ganzem Herzen für die vielen
aufmunternden Worte, das stete Daumendrücken und ihre gedankliche Anwesenheit. Susanne
möchte ich für ihre Freude, Tränen und Liebe danken.


















“Au football, tout est compliqué par la présence de l'équipe adverse”
Jean-Paul Sartre








IContents
1 Summary ......................................................................................................1
2 Introduction .................................................................................................2
2.1 Protein folding..............................................................................................................2
2.1.1 Protein folding problem 3
2.1.2 Protein folding mechanisms and energy landscapes........................................................... 3
2.1.3 Folding of small and large proteins..................................................................................... 5
2.2 Protein folding in vivo..................................................................................................6
2.2.1 Protein aggregation ............................................................................................................. 6
2.2.2 Macromolecular crowding 6
2.2.3 Nascent polypeptide chains................................................................................................. 7
2.2.4 Molecular chaperones ......................................................................................................... 9
2.3 A chaperone network in the eukaryotic cytosol........................................................10
2.3.1 Ribosome associated factors ............................................................................................... 10
2.3.2 The Hsp70 chaperones........................................................................................................ 11
2.3.3 The chaperonin TRiC.......................................................................................................... 13
2.3.4 GimC/Prefoldin................................................................................................................... 16
2.3.5 Hsp90 .................................................................................................................................. 17
2.3.6 Chaperone-mediated protein degradation ........................................................................... 17
2.4 Aberrant protein folding and conformational diseases............................................19
2.4.1 Protein aggregation and amyloid-like deposits................................................................... 20
2.4.1.1 Structure and formation of amyloid fibrils...............................................................................20
2.4.1.2 Protein aggregation and toxicity...............................................................................................22
2.4.2 Huntington’s disease........................................................................................................... 24
2.4.2.1 Huntingtin ................................................................................................................................24
2.4.2.2 PolyQ aggregation....................................................................................................................25
2.4.2.3 The nature of toxic species in polyQ aggregation ....................................................................27
2.4.2.4 Mechanisms of polyQ aggregation mediated toxicity..............................................................28
2.4.2.5 Transcriptional dysregulation...................................................................................................29
2.4.2.6 Molecular chaperones in polyQ aggregation and toxicity........................................................31
2.5 Aim of thesis .................................................................................................................34
3 Material and Methods.................................................................................35
3.1 Material ........................................................................................................................35
3.1.1 Instruments.......................................................................................................................... 35
3.1.2 Chemicals............................................................................................................................ 35
3.1.3 Buffers and Media............................................................................................................... 37
3.1.4 Antisera........ 38
3.1.5 Bacterial and yeast strains, mammalian cell lines............................................................... 39
3.1.6 Plasmids and oligonucleotides............................................................................................ 40
3.2 Methods ........................................................................................................................41
3.2.1 Molecular biological methods............................................................................................. 41
IIContents
3.2.1.1 Plasmid DNA purification........................................................................................................41
3.2.1.2 Determination of DNA concentration ......................................................................................41
3.2.1.3 Plasmid DNA sequencing ........................................................................................................41
3.2.1.4 DNA restriction digestion ........................................................................................................41
3.2.1.5 Dephosphorylation of DNA fragments ....................................................................................42
3.2.1.6 5’-DNA end overhand fill in ............................................................................................