Regulation und Bedeutung von angiogenen, anti-angiogenen und lymphangiogenen Faktoren während verschiedener Stadien der Ovarfunktion beim Rind [Elektronische Ressource] / von Stefanie Schilffarth

Stefanie Schilffarth

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• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 72
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 2 Mo

Extrait

Aus dem Lehrstuhl für Physiologie
der Technischen Universität München


Arbeit angefertigt unter der Leitung von
PD Dr. Bajram Berisha




Vorgelegt über
Prof. Dr. Dr. Dr. habil. Fred Sinowatz,
Lehrstuhl für Tieranatomie II
Ludwig-Maximilians-Universität München






Regulation und Bedeutung von angiogenen, anti-angiogenen
und lymphangiogenen Faktoren während verschiedener Stadien
der Ovarfunktion beim Rind






Inaugural-Disseration


zur Erlangung der tiermedizinischen Doktorwürde
der Tierärztlichen Fakultät
der Ludwig-Maximilians-Universität München





von

Stefanie Schilffarth

aus

Nürnberg/Bayern




München, 2009


Gedruckt mit Genehmigung der Tierärztlichen Fakultät der
Ludwig-Maximilians-Universität München





Dekan: Univ.-Prof. Dr. Braun

1. Berichterstatter: Univ.-Prof. Dr. Sinowatz

1. Korreferent: Univ.-Prof. Dr. Zerbe
2. Korreferent: Dr. Braun
3. Korreferent: Priv.-Doz. Dr. Scholz
4. Priv.-Doz. Dr. Schalch



Tag der Promotion: 06. Februar 2009























„Nichts auf der Welt kann Ausdauer ersetzen.
Talent jedenfalls nicht – nichts ist so häufig wie erfolglose Leute mit Talent.
Auch Genialität nicht – verkannte Genies sind sprichwörtlich.
Allein Beharrlichkeit und Entschlossenheit sind allmächtig.“


Calvin Coolidge, ehem. Präsident der USA
















Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis 5

1. Einleitung und Aufgabenstellung 7

2. Literatur 9
2.1 Ovar und endokrinologische Regulation des bovinen Zyklus 9
2.1.1 Follikulogenese 11
2.1.2 Ovulation 13
2.1.3 Gelbkörperfunktion 14
2.1.4 Luteolyse (Regression) des Gelbkörpers (CL) 15
2.1.5 Gonadotropine und Prostaglandine 15
2.1.6 Steroidhormone Aromatase 16
2.2 Lokale (auto- und parakrine) Regulationsfaktoren 17
2.3 Das Gefäßsystem im Ovar des Rindes 18
2.4 Angiogenese 19
2.5 Angiogene Faktoren 23
2.5.1 VEGF-Familie: VEGF-A, VEGF -B und ihre Isoformen 23
2.5.2 Neuropilin-1 und Neuropilin-2 (Npr.) 29
2.5.3 Hypoxie-induzierbarer-Faktor 1 (HIF-1) 31
2.6.Anti-angiogene Faktoren 32
2.6.1 Vasohibin-1 und Vasohibin-2 34
2.6.2 Thrombospondin-1 und Thrombospondin-2 (TSP) 36
2.6.3 Oberflächenantigene CD36 und CD47 37
2.7 Lymphangiogenese 38
2.8 Lymphangiogene Faktoren 41
2.8.1 VEGF-Familie: VEGF-C, VEGF-D und VEGF-R3 42
2.8.2 Blutplättchen-abgeleitete Wachstumsfaktoren (PDGF-Familie) 43
2.8.3 Podoplanin 45
2.8.4 Homeobox-containig Transcription Factor Prox1 (Prox-1) 46









1 Inhaltsverzeichnis
3. Material und Methodik 48

3.1 Labortechnik und Geräte 48
3.2 Biochemika 50
3.3 Reagenzien 1
3.4 Kits 5
3.5 Enzyme 2
3.6 Marker
3.7 Puffer und Lösungen 52
3.8 Primersequenzen und Produktlängen der qPCR 54
3.9 Primerdesign 55
3.10 Probenmaterial und Probengewinnung 56
3.10.1 Experiment 1: Gelbkörper (CL) während Zyklus und Gravidität 56
3.10.2 2: Gelbkörper (CL) nach induzierter Luteolyse durch PGF2 α 57
3.10.3 Experiment 3: Follikel während verschiedener Entwicklungsstufen 58
3.11 RNA-Extraktion 60
3.12 Überprüfung der Quantität und Qualität der RNA 61
3.12.1 Messung des RNA-Gehaltes in der Lösung 61
3.12.3 RNA-Qualitätskontolle 62
3.13 Reverse Transkription 64
3.14 Primeroptimierung 5
3.14.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 66
3.14.2 Gelelektrophorese mit Agarosegel und Sequenzierung 67
3.15 Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) 69
3.16 Housekeeping-Gene 74
3.17 Protein-Extraktion 76
3.18 Enzymimmuntest (EIA) 7
3.18.1 Oestradiol-17 β (E2) und Progesteron (P4) in der Follikelflüssigkeit (FF) 76
3.18.2 Kommerzielle ELISA-Kits (VEGF-C und VEGF-D) 77
3.18.3 Kommerzielles DuoSet für ELISA (VEGF-R3) 79
3.19 Immunhistochemie 80
3.18.1 Nachweis für HIF-1 α an Gefrierschnitten von CL 80
3.18.2 Nachweis für VEGF-R3 an Gefrierschnitten von CL 80
3.18.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 81
3.20 Datenverarbeitung 1



2 Inhaltsverzeichnis
4. Ergebnisse 82

4.1 Housekeeping-Gen 82
4.2 Angiogene Faktoren 85
4.2.1 VEGF-A, VEGF-B und ihre Isoformen
4.2.2 Neuropilin-1 und Neuropilin-2 (Nrp.) 93
4.2.3 Hypoxie-induzierbarer-Faktor (HIF-1 α) 98
4.2.3.1 Expression der mRNA
4.2.3.2 Proteinlokalistation (Immunhistochemie) 100
4.3 Anti-angiogene Faktoren 103
4.3.1 Vasohibin-1 und Vasohibin-2 103
4.3.2 Thrombospondin-1 und Thrombospondin-2 (TSP) 106
4.3.3 Oberflächenantigene CD36 und CD47 109
4.4 Lymphangiogene Faktoren 113
4.4.1 VEGFC, VEGF-D und VEGF-R3 113
4.4.1.1 Expression der mRNA und Proteinkonzentration (ELISA) 113
4.4.1.2 Proteinlokalistation (Immunhistochemie) 120
4.4.2 Blutplättchen-abgeleitete Wachstumsfaktoren (PFGF-Familie) 122
4.4.3 Podoplanin 127
4.4.4 Homeobox-containig Transcription Factor Prox1 (Prox-1) 128

5. Diskussion 130

5.1 Normalisierung der mRNA-Expressionsdaten 130
5.2 Angiogene Faktoren 131
5.2.1 VEGF-A, VEGF-B und ihre Isoformen 131
5.2.2 Neuropillin-1 und Neuropilin-2 (Nrp.) 135
5.2.3 Hypoxie-induzierbarer-Faktor (HIF-1 α) 137
5.3 Anti-angiogene Faktoren 139
5.3.1 Vasohibin-1 und Vasohibin -2 140
5.3.2 Thrombospondin-1 und Thrombospondin-2 (TSP) 141
5.3.3 Oberflächenantigene CD36 und CD47 142
5.4 Lymphangiogene Faktoren 143
5.4.1 VEGF-C, VEGF-D und VEGF-R3 143
5.4.3. Blutplättchen-abgeleitete Wachstumsfaktoren (PFGF-Familie) 147
5.5.2 Podoplanin 148
5.5.3 Homeobox-containig Transcription Factor Prox1 (Prox-1) 149
5.5 Schematische Darstellung der Expressionsprofile der untersuchten Faktoren 150

3 Inhaltsverzeichnis
6. Zusammenfassung 153

7. Sumary 156
8.Literaturverzeichnis 159

Danksagung 176

Lebenslauf 177

4 Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis

18S rRNA RNA der 18s Ribosomen Untereinheit (18s)
28S rRNA RNA der 28s Ribosomen Untereinheit (28s)
Abb. Abbildung
AK Antikörper
bp Basenpaare
BSA bovines Serumalbumin
CD 36/47 Oberflächenantigene 36/47 (CD = cluster of differentiation)
cDNA complementary DNA (Komlementärstrang-DNA)
CL Corpus luteum, bzw. Corpura lutea (Gelbkörper)
cp Crossing Point(s)
d Tage (days)
DAB 3,3’-Diaminobenzidinetetrahydrochloridedihydrate
DEPC Diethylpyrocarbonat
DNA Desoxyribonukleinsäure
DNase uklease
dNTP Desoxy-Nukleosid 5’-Triphosphat
E2 Östradiol-17 β
EC Endothelzelle(n)
EIA Enzyme Immuno Assay
EtOH Ethanol
FF Follikelflüssigkeit
for forward
FSH lstimulierendes Hormon
GAPDH Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogensase
G/C-Gahalt Gehalt an Guanin-und Cytosin-Basen
GnRH Gonadotropin freisetzendes Hormon (Gonadotropin-Releasing
Hormon)
h Stunde(n)
HA Hyaluronsäure
HIF-1 α Hypoxie-induzierbarer-Faktor 1 α (Hypoxia-inducible Factor 1 α)
HKG Housekeeping Gen
HSPG Heparan-Sulfat-Proteoglykan
iNOS induzierbare NO-Synthase
KO Knockout
LEC Lymphendothelzellen
5 Abkürzungsverzeichnis
LH Luteinisierendes Hormon
LYVE-1 Lymphgefäß-Hyaluronsäure-Rezeptor-1
Min Minute(n)
mRNA messenger RNA
Nrp. Neuropilin(e)
P4 Progesteron
PBS Phosphat gepufferte Salzlösung (Pho