//img.uscri.be/pth/7298762cd2aa62610a64c3586fb5fd93a75261a0
Cet ouvrage fait partie de la bibliothèque YouScribe
Obtenez un accès à la bibliothèque pour le lire en ligne
En savoir plus

Relocalisation nucléaire du gène mitochondrial ATP9 chez la levure Saccharomyces cerevisiae

De
432 pages
Sous la direction de Jean-Paul Di Rago
Thèse soutenue le 22 décembre 2009: Bordeaux 2
L'ancêtre a-protéobactérie endosymbiotique à l'origine des mitochondries avait son propre génome, codant pour de nombreuses fonctions redondantes, voire totalement inutiles dans la cellule hôte. Ces informations ont disparu avec le temps, alors que les autres gènes indispensables ont en grande partie été transférés au noyau de la cellule eucaryote. Aujourd'hui, plus de quatre vingt quinze pourcents des protéines mitochondriales sont codées par le génome nucléaire. La question se pose de savoir pourquoi ces gènes sont maintenus dans les organites. Une manière de répondre expérimentalement à cette question consiste à relocaliser artificiellement au noyau les gènes des organites. Nous avons testé cette relocalisation nucléaire chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Une première étape de l'étude a consisté à déléter le gène mitochondrial ATP9 natif. La délétion du gène ATP9 mitochondrial chez S. cerevisiae conduit à de multiples effets délétères sur la stabilité du génome mitochondrial, son expression, le contenu en complexes de la chaîne respiratoire, mais aussi sur la morphologie des mitochondries. Des expériences antérieures, décrites dans la littérature, avaient échouées dans la relocalisation nucléaire du gène ATP9 de S. cerevisiae. J'ai réussi la relocalisation nucléaire de ce gène chez la levure par une approche différente, avec cette fois un gène ATP9 déjà nucléaire, celui de Podospora anserina. Malgré une différence de 30% dans la séquence primaire des protéines, la protéine Atp9p de P. anserina exprimée depuis le noyau chez S. cerevisiae peut complémenter la délétion mitochondriale du gène ATP9. La levure modifiée peut former des ATP synthases hybrides ayant une bonne activité in vitro. En parallèle de cela, le travail sur P. anserina a donné lieu à une collaboration qui nous a permis d'en savoir un peu plus sur l'expression des deux gènes ATP9 de ce champignon filamenteux. Notons que P. anserina a deux gènes ATP9, nativement nucléaires, chacun étant exprimés à des moments précis du cycle de vie de ce champignon filamenteux. Dans l'évolution, le transfert fonctionnel du gène ATP9 chez P. anserina, comme chez les mammifères, a permis l'acquisition d'un mécanisme de régulation de la quantité d'ATP synthase en fonction des conditions physiologiques de la cellule.
-Mitochondries
-Evolution
-Génome mitochondrial
The endosymbiotic a-protéobacteria ancestor of mitochondria had its own genome, specifying rebounding functions, sometimes useless inside the host cell. This piece of information have been lost during the evolution, while other essential genes have in part been transferred to the nucleus of the eukaryotic cell. Nowadays, more than 95% of the mitochondrial proteins are encoded by the nucleus. We ask the question of why there is still genes remaining in the mitochondrial genome. One way to answer experimentally that question is to artificially relocalize those mitochondrial genes to the nucleus. We have tested the nuclear relocation in Saccharomyces cerevisiae. A first step consisted in deleting the mitochondrial ATP9 gene. This deletion led to multiple deleterious effects on the stability of the mitochondrial genome, its expression, on the content of the respiratory complexes, but also on the mitochondrial morphology. Previous studies, described in the literature, have failed in the nuclear relocation of ATP9 of S. cerevisiae. I succeeded in the nuclear relocation of ATP9 using an already nuclear version of the gene, that of Podospora anserina. Despite a 30% divergence of the proteic sequences, the Atp9p of P. anserina expressed from the nucleus in S. cerevisiae can complement the ATP9 deletion. The modified yeast can form hybrid ATP synthases with a rather good in vitro activity. In parallel to that work on P. anserina, this has led to a collaboration which gave us more information on the expression of ATP9 in P. anserina. It is to notify that P. anserina has two ATP9 genes, natively nuclear, each of them being expressed at different times during the life cycle of the fungus. During evolution, the functional transfer of ATP9 to the nucleus, like it is the case in mammals too, has allowed the acquisition of regulatory mechanisms to control the amount of ATP synthases depending on physiological constraints of the cell.
Source: http://www.theses.fr/2009BOR21691/document
Voir plus Voir moins

Année 2009 Thèse n° 1691




THÈSE
pour le
DOCTORAT DE L'UNIVERSITÉ BORDEAUX 2



Mention : Sciences, Technologie, Santé
Option : Génétique





Présentée et soutenue publiquement

Le 22 Décembre 2009
Par Maïlis BIETENHADER
Née le 2 Juillet 1983 à Talence






RELOCALISATION NUCLÉAIRE DU GÈNE MITOCHONDRIAL
ATP9 CHEZ LA LEVURE SACCHAROMYCES CEREVISIAE









Membres du jury

Mme le Professeur Corinne CLAVÉ Examinateur
Mr le Directeur de recherche Bernard GUIARD Examinateur
Mr le Professeur Alexandre TZAGOLOFF Rapporteur
Mr le Directeur de recherche Francis-André WOLLMAN Rapporteur
Mr le Directeur de recherche Jean VELOURS Président du jury
Mr le Directeur de recherche Jean-Paul DI RAGO Directeur de thèse.
• Sommaire des figures et tableaux......................................................................................8
• Abréviations..................................................................................................................11
• Objectifs........................................................................................................................13
• Introduction..................................................................................................................16
CHAPITRE I Les organites...............................................................................................16
A. Les théories de l'endosymbiose .................................................................................16
1. Bénéfices énergétiques...........................................................................................17
2. Le métabolisme de l'oxygène.................................................................................18
3. L'hypothèse hydrogène ..........................................................................................18
B. Les mitosomes et hydrogénosomes ...........................................................................18
C. Les plastes des cellules végétales ..............................................................................19
D. Les mitochondries.....................................................................................................20
1. L'ADNmt...............................................................................................................20
2. Dynamique mitochondriale....................................................................................22
3. Transmission des organites ....................................................................................22
4. Quelques fonctions mitochondriales.......................................................................23
5. Le système énergétique mitochondrial ...................................................................24
CHAPITRE II L'ATP synthase..........................................................................................26
A. Le secteur globulaire F et la tige centrale.................................................................28 1
B. Le secteur F .............................................................................................................29 0
1. Le pied périphérique..............................................................................................29
2. Fonctionnement du canal à protons........................................................................30
3. Facteurs gouvernant l'expression et l'assemblage du secteur F ..............................31 0
4. Les mutations dans ATP6, ATP8 ou ATP9 et leurs répercussions ...........................32
C. Dimérisation du complexe.........................................................................................33
CHAPITRE III Import des protéines à la mitochondrie......................................................34
A. Les protéines codées par le génome mitochondrial....................................................34
B. L'adressage à la mitochondrie ...................................................................................35
C. Complexes de transport.............................................................................................36
1. La membrane externe.............................................................................................36
2. La membrane interne .............................................................................................37
D. L'orientation des protéines membranaires .................................................................38
E. Comparaison avec les systèmes bactériens ................................................................39
1 CHAPITRE IV Evolution du génome des organites...........................................................40
A. Les ancêtres des mitochondries.................................................................................40
B. Quelle information reste-t-il dans la mitochondrie aujourd'hui?.................................41
C. Les différences de code génétique.............................................................................43
D. Transferts génétiques entre le noyau et la mitochondrie ............................................44
E. Comment est-ce possible ? ........................................................................................46
1. Dégradation, brèches dans les membranes des organites ........................................46
2. Quel vecteur d'information ?..................................................................................46
3. Réparation des ruptures dans la double hélice ........................................................47
F. Le cas du gène COX2 ................................................................................................47
G. Les cas où ATP9 est spécifié par le noyau.................................................................48
CHAPITRE V Les différentes hypothèses pour la rétention d'information dans les organites
49
A. Les aspects positifs de la relocalisation .....................................................................49
1. Le cliquet de Muller...............................................................................................49
2. Protection du matériel génétique mitochondrial .....................................................50
3. Avantage sélectif de la taille du génome ................................................................50
B. Les éventuelles barrières à la relocalisation totale du matériel génétique des organites
51
1. Hypothèse de disparité des codes génétiques..........................................................51
2. Hypothèse d'hydrophobicité...................................................................................51
3. Un coût énergétique...............................................................................................52
4. Co-localisation du gène et de son produit...............................................................53
a) L'hypothèse CORR ('Co-location for redox regulation').....................................53
b) CES : Contrôle par épistasie de synthèse............................................................55
C. Principes d'une relocalisation fonctionnelle au noyau d'un gène mitochondrial..........56
CHAPITRE VI Les expériences de relocalisation..............................................................58
A. Le gène codant pour une maturase mitochondriale chez la levure..............................58
B. Le gène codant pour la sous-unité 8 de l'ATP synthase..............................................58
C. Le gène VAR1...........................................................................................................59
D. ATP9 chez les plantes ...............................................................................................59
E. RbcL, chez le chloroplaste de Nicotiana tabacum......................................................60
F. Le gène COB, exclusivement mitochondrial ..............................................................60
G. Le gène codant pour la sous-unité 6 de l'ATP synthase .............................................61
2 H. Le gène codant pour la sous-unité 9 de l'ATP synthase de levure ..............................62
• Matériel et méthodes ....................................................................................................63
CHAPITRE I Souches, milieux de culture et plasmides.....................................................63
A. Souches de bactéries et levures .................................................................................63
B. Milieux de culture.....................................................................................................63
C. Culture et conservation des souches ..........................................................................64
D. Vecteurs ...................................................................................................................64
CHAPITRE II Techniques de génétique ............................................................................65
A. Croisement entre souches de levures.........................................................................65
B. Cytoduction ..............................................................................................................65
-C. Estimation de la proportion de cellules ! /!° dans une population cellulaire..............65
D. Recherche de révertants ............................................................................................66
1. Révertants spontanés..............................................................................................66
a) Recherche de révertants sur tapis cellulaires.......................................................66
b) recherche de révertants à long terme en milieu liquide.......................................66
CHAPITRE III Techniques de biologie moléculaire..........................................................66
A. Clonage sur plasmide................................................................................................66
B. Plasmid swap ............................................................................................................67
C. Préparation de l'ADN plasmidique ............................................................................67
D. Transformation de bactéries......................................................................................67
1. Electroporation ......................................................................................................68
a) XL1blue électrocompétentes..............................................................................68
b) Choc électrique..................................................................................................68
2. Transformation par choc thermique........................................................................68
a) Préparation – compétence des bactéries..............................................................68
b) Choc thermique .................................................................................................68
E. Transformation de levure ..........................................................................................69
1. Transformation chimique des cellules de levure.....................................................69
2. Transformation mitochondriale par la technique de biolistique...............................69
F. Séquences nucléotidiques ..........................................................................................70
1. Extraction des acides nucléiques (ADN et ARN) mitochondriaux..........................70
2. Extraction des ADN génomiques totaux.................................................................70
3. Extraction d'ARN totaux........................................................................................71
4. Récupération/Restitution de plasmide chez la levure ('Plasmid recovery')..............71
3