Rôle des acides aminés dans la régulation de l'expression des gênes hépatiques du métabolisme intermédiaire chez la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss), Role of amino acids on the regulation of intermediary metabolism related gene expression in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) liver

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Sous la direction de Stéphane Panserat
Thèse soutenue le 30 septembre 2010: Bordeaux 1
Ce travail de thèse avait pour objectif d’étudier la régulation de l’expression des gènes du métabolisme intermédiaire par les acides aminés alimentaires dans le foie de truite arc-en-ciel. Ces études ont permis de caractériser, pour la première fois dans le foie de truite, les principaux acteurs de la voie de signalisation Akt/TOR et leurs régulations. Nos résultats in vitro montrent qu’un mélange d’acides aminés, seul ou avec l’insuline, est capable de réguler l’expression de nombreux gènes impliqués dans la lipogenèse, la néoglucogenèse et la glycolyse. Les régulations observées en présence conjointe d’un mélange d’acides aminés et d’insuline semblent être, pour la plupart, dépendantes de la voie TOR. Par la suite, nous avons étudié l’effet de certains acides aminés comme la leucine (connue pour son effet « signal ») ainsi que la lysine et la méthionine (souvent ajoutées dans les aliments piscicoles riches en matières premières végétales afin d’atteindre l’équilibre en acides aminés). En présence d’insuline, la leucine, contrairement à la lysine et la méthionine, active la voie de signalisation TOR et régule l’expression de certains gènes (néoglucogenèse et lipogenèse) de façon similaire à un mélange d’acides aminés. Parallèlement, in vivo, nous avons étudié la régulation de l’expression des gènes du métabolisme intermédiaire lors d’un remplacement partiel ou total des huiles et farines de poisson par des produits végétaux dans l’aliment piscicole. Cette expérimentation a montré que, ni les voies de signalisation Akt/TOR, ni l’expression des gènes cibles ne sont affectés par ces nouveaux aliments. En conclusion, ces travaux ont montré que les acides aminés semblent jouer un rôle important dans la régulation de l’expression des gènes hépatiques du métabolisme intermédiaire chez la truite arc-en-ciel.
-Truite arc-en-ciel
-Foie
-Métabolisme
-Acides aminés
-Insuline
-Expression de gène
-Signalisation Akt/TOR
The objective of my PhD was to characterize the regulation of the intermediary metabolism related gene expression by dietary amino acids in the liver of rainbow trout. This work allowed us to characterize, for the first time in the liver of trout, the main proteins of the Akt/TOR signalling pathway and their regulations. In vitro results showed that a mixture of amino acids, in the presence or absence of insulin, is able to regulate the expression of numerous genes involved in lipolysis, gluconeogenesis and glycolysis. Such regulations induced by an amino acid mix together with insulin appear to be, at least partly, TOR-dependent. Afterwards, I studied the effect of specific amino acids known to be a signalling molecule (leucine) or having potential application as supplements to reach essential amino acid balance in plant ingredients-rich diet (lysine and methionine). In the presence of insulin, leucine, in contrast to lysine and methionine, is able to activate the TOR signalling pathway and regulate the expression of several genes involved in gluconeogenesis and lipogenesis in the same way as a mixture of amino acids. Furthermore, we studied in vivo, the effect of partial or total replacement of fish oil and fish meal by plant products in fish feed on .the regulation of intermediary metabolism related gene expression. This study showed that neither Akt/TOR signalling pathway nor the expression of the target genes were affected by such diets. In conclusion, these studies showed that amino acids seem to play an important role in the hepatic regulation of intermediary metabolism gene expression in the rainbow trout.
-Rainbow trout
-Liver
-Metabolism
-Amino acid
-Insulin
-Gene expression
-Akt/TOR signalling pathway
Source: http://www.theses.fr/2010BOR14069/document

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THESE

Présentée à

L’UNIVERSITE BORDEAUX 1

ECOLE DOCTORALE
DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE


par Mlle Marine LANSARD

POUR OBTENIR LE GRADE DE

DOCTEUR

SPECIALITE : SCIENCES DES ALIMENTS ET NUTRITION


***********************
ROLE DES ACIDES AMINES DANS LA REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES
HEPATIQUES DU METABOLISME INTERMEDIAIRE CHEZ LA TRUITE ARC-EN-CIEL
(Oncorhynchus mykiss)




Soutenue le 30 Septembre 2010

Après avis de :

Mme Sophie TESSERAUD, Directrice de Recherches, INRA Rapporteurs
Mr Pierre FAFOURNOUX, Directeur de Recherches, CNRS

Devant la commission d’examen formée de :

Mr Paul HIGUERET, Professeur Université de Bordeaux 1 Président
Mme Dalila AZZOUT-MARNICHE, Maître de Conférences, Agroparistech Examinateurs
Mr Benoit FAUCONNEAU, Directeur de Recherches, INRA
Mr Jean-Charles GABILLARD, Chargé de Recherches, INRA
Mr Stéphane PANSERAT, Directeur de Recherches, INRA
Mme Sandrine SKIBA, Chargée de Recherches, INRA

















































REMERCIEMENTS

Ce travail de thèse a été financé par le projet européen AQUAMAX. Il a été réalisé à l’INRA
de Saint Pée-sur-Nivelle au sein de l’unité NuAGe dirigée par Sachi Kaushik puis par
Françoise Médale que je remercie vivement pour leur accueil au sein du laboratoire.

Je remercie sincèrement le Professeur Paul Higueret, Sophie Tesseraud et Pierre
Fafournoux ainsi que Dalila Azzout-Marniche, Benoit Fauconneau et Jean-Charles Gabillard
qui ont accepté respectivement d’être président, rapporteurs et examinateurs de cette thèse.

Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance à mon directeur de thèse, Stéphane Panserat,
pour la qualité de son encadrement scientifique et le partage de ses connaissances. Je
souhaite aussi le remercier pour sa grande disponibilité, ses conseils et son soutien au
quotidien.

Je remercie également très sincèrement, Sandrine Skiba, responsable scientifique de cette
thèse, pour sa confiance, son dynamisme, ses conseils et son aide précieuse tout au long de
ces années. Je la remercie de m’avoir accueillie dans son bureau me permettant ainsi de
pouvoir rédiger cette thèse dans de bonnes conditions.

Un très grand merci à Elisabeth Plagnes-Juan qui, avec patience et enthousiasme, m’a initié
à la culture cellulaire. Je la remercie aussi pour son aide et ses conseils en biologie
moléculaire ainsi que pour son soutien et son écoute. Travailler avec Elisabeth a été un réel
plaisir.

Je remercie aussi Iban Seiliez pour nos échanges concernant les manips et les résultats, ses
conseils et sa bonne humeur. Je souhaite également remercier Sachi Kaushik et Inge
Guerden pour leurs encouragements et la correction de l’anglais de mes articles.

Un merci tout particulier à Mélanie Larquier, Karine Dias et Charline Chauvin pour leur aide
dans l’obtention des résultats, leur écoute et les moments de détente.

Je tiens à remercier Christiane Vachot pour son aide lors des prélèvements et dans la
réalisation de certains dosages, Frédéric Terrier, Franck Sandres et Yves Hontang de la
pisciculture de Donzacq ainsi que Peyo Aguirre et Yvan Mercier d’avoir patiemment pris soin
de mes précieuses petites truites. Je remercie également Philippe Laborde de s’être occupé de nombreuses fois d’un autre type de petites bêtes bien plus méchantes ayant infecté mon
ordinateur.

Mes remerciements vont aussi à tous les membres de la station pour leur accueil chaleureux
et notamment, Geneviève Corraze, Marie-Christine Artola, Marie-Josée Elissalde, Elisabeth
Azcarraga, Maryse Pin, Marie-Josée Borthaire, Laurence Larroquet, Georges Choubert,
Didier Bazin, Stéphanie Fontagné, Anne Surget, Pantxoa Ostiz et Maïté Jorajuria pour leur
soutien et leur sympathie. Un grand merci aussi à tous les étudiants que j’ai pu rencontrer et
en particulier à Morgane, Cathy, Lénaïg, Emilie, Sergio, Thomas et Franco.

Enfin, mes profonds remerciements vont vers mes proches, famille et amis. Je tiens à
remercier de tout cœur mes parents et mes frères pour leur affection et leur soutien
indéfectible d’où qu’ils se trouvent à travers le monde. Une mention toute spéciale à Jérôme
qui a accepté de me suivre dans cette aventure jusqu'à Bayonne, m’a soutenue tout au long
de ces années et a toujours été présent y compris lors des moments de doute.




























PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS

Liste des publications dans des journaux internationaux à comité de lecture

Lansard M., Panserat S., Seiliez I., Polakof S., Plagnes-Juan E., Geurden I., Médale F.,
Kaushik S., Corraze G., Skiba-Cassy S. (2009). Hepatic protein kinase B (Akt)- target of
rapamycine (TOR)-signalling pathways and intermediary metabolism in rainbow trout
(Oncorhynchus mykiss) are not significantly affected by feeding plant-based diets. British
Journal of Nutrition; 102: 1564-1573

Lansard M., Panserat S., Plagnes-Juan E., Seiliez I., Skiba-Cassy S. (2010) Integration of
insulin and amino acid signals that regulate hepatic metabolism-related gene expression in
rainbow trout: role of TOR. Amino Acids; 39: 801-810

Lansard M., Panserat S., Plagnes-Juan E., Dias K., Seiliez I., Skiba-Cassy S. Effect of
single amino acid leucine, methionine and lysine on carbohydrate and lipid metabolism-
related gene expression in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)) hepatocytes. Journal of
Nutrition, sous presse.

Plagnes-Juan E., Lansard M., Seiliez I., Médale F., Corraze G., Kaushik S., Panserat S.,
Skiba-Cassy S. (2008). Insulin regulates the expression of several metabolism-related genes
in the liver and primary hepatocytes of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Journal of
Experimental Biology; 211:2510-8.

Skiba-Cassy S, Lansard M, Panserat S., Médale F. (2009) Rainbow trout genetically
selected for greater muscle fat content display increased activation of liver TOR signaling
and lipogenic gene expression. American Journal of Physiology: 297: 1421-1429

Panserat S., Hortopan G. A., Plagnes-Juan E., Kolditz C., Lansard M., Skiba-Cassy S.,
Esquerre D., Geurden I., Medale F., Kaushik S., Corraze, G. (2009) Differential gene
expression after total replacement of dietary fish meal and fish oil by plant products in
rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) liver. Aquaculture : 294 : 123-131

Panserat, S., Skiba-Cassy, S., Seiliez, I., Lansard, M., Plagnes-Juan, E., Vachot, C.,
Aguirre, P., Larroquet, L., Chavernac, G., Medale, F., Corraze, G., Kaushik, S., Moon, T. W.
(2009) Metformin improves postprandial glucose homeostasis in rainbow trout fed dietary
carbohydrates: a link with the induction of hepatic lipogenic capacities?. American Journal of
Physiology: 297: 707-715

Liste des communications dans des congrès nationaux et internationaux :

Communication orales :

Lansard M., Panserat S., Seiliez I., Polakof S., Plagnes-Juan E., Geurden I., Médale F.,
Kaushik S., Corraze G., Skiba-Cassy S. Plant-based diets for rainbow trout (Oncorhynchus
mykiss): Effect on hepatic insulin-TOR signalling pathways and intermediary metabolism.
th st th13 international symposium on nutrition and feeding in fish. 1 -5 June 2008, Florianopolis,
Brazil.
Lansard M., Panserat S., Seiliez I., Plagnes-Juan E., Skiba-Cassy S. Effets des acides
aminés sur l’expression des gènes du métabolisme intermédiaire dans des hépatocytes de
truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss). Journée Scientifique de l'Ecole Doctorale des
Sciences de la Vie et de la Santé. Arcachon, France. April 8, 2009.

Lansard M., Panserat S., Seiliez I., Plagnes-Juan E., Skiba-Cassy S. Hepatic Akt-TOR
signaling pathway and intermediary metabolism: Regulation in trout fed with plant based diet
and assessment of amino acids effect. European research project Aquamax “Sustainable
aquafeeds to maximise the health benefits of farmed fish for consumers”, Annual meeting.
Budapest, Hungary. October 26-28, 2009.

Skiba-Cassy S., Plagnes-Juan E., Lansard M., Seiliez I., Medale F., Corraze G., Kaushik S.,
Panserat S. (2008) Insulin regulates the expression of several metabolism-related genes in
ththe liver and primary hepatocytes of rainbow trout. 13 international symposium on nutrition
st thand feeding in fish. 1 -5 June, Florianopolis, Brazil.

Communication affichées :

Lansard M., Panserat S., Plagnes-Juan E., Seiliez I., Skiba-Cassy S. Caractérisation de la
voie de signalisation de l’insuline dans le foie de truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss).
Journée Scientifique de l’Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé. Arcachon,
France. April 16, 2008.
Lansard M., Panserat S., Plagnes-Juan E., Seiliez I., Skiba-Cassy S. Amino acids regulate
hepatic metabolism-related gene expression ». 19th International Congress of Nutrition.
Bangkok, Thailand. October 4-9, 2009.

S Skiba-Cassy, M Lansard, C Vachot, S Panserat and F Médale (2009) Genetic selection on
muscle fat content increased TOR signalling pathway and lipogenic gene expression. 9th
th thInternational Congress of Nutrition 4 -9 October, Bangkok, Thailand.

Panserat S, Skiba-Cassy S, Seiliez I, Lansard M, Plagnes-Juan E, Vachot C, Aguirre P,
Larroquet L, Charvegnac G, Medale F, Corraze G, Kaushik S & Moon TW (2009) Metformin
improves postprandial glucose homeostasis in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fed high
levels of dietary carbohydrates: a potential link with the induction of hepatic lipogenic
th thcapacities? 9th International Congress of Nutrition 4 -9 October, Bangkok, Thailand.


























































LISTE DES ABREVIATIONS


AAR : Amino acid response
ADN : Acide désoxyribonucléique
ADNc : Acide désoxyribonucléique complémentaire
ADP : Adénosine diphosphate
Akt/PKB : protein kinase B related to AKR mouse T-cell lymphoma-derived oncogenic product
ARN : Acide ribonucléique
ARNm : Acide ribonucléique messager
ARNm 5'TOP : 5'terminal oligopyrimidine tract
ATP : Adénosine triphosphate
BM : Biomasse
BSA : Serum albumine bovine
C/EBP: CCAAT/enhancer binding protein
CoA : Coenzyme A
cPEPCK : phosphoénol carboxykinase cytosolique
CPT1 : Carnitine palmitoyltransferase 1
EDTA : Acide éthylène diamine tétraacétique
EF1a : Elongation factor 1 a
EGTA: acide éthylène glycol tétraacétique
FAS : Fatty acid synthase
FBPase : Fructose-1,6-bisphophatase
Foxo : Forkhead transcription factor
G6Pase : Glucose-6-phosphatase
GCN2 : General control non-repressible 2
GK : Glucokinase
Glut : transporteur de glucose
HNF : Hepactic nuclear factor
HK : Hexokinase
IRS : Insuline receptor substrate
kDA : kilo Dalton
MAPK : Mitogen activated protein Kinase
mPEPCK : phosphoénol carboxykinase mitochondriale
MS : Matière sèche
mTOR : Mamalian target of rapamycine
NLS : Nuclear localisation signal
p70S6K : 70 kDa ribosomal protein S6 kinase
PCR : Polymerase chain reaction
PDK-1 : Phosphoinositide-dependent-kinase-1
PEPCK : Phosphoénolpyruvate carboxykinase
PI3K : Phosphatidylinositol-3'Kinase
PK : Pyruvate kinase
PKC : Protein kinase C
Raptor : regulatory associated protein of mTOR
Rheb : Ras homologue enriched brain
Rictor : Rapamycin-insensitive companion of mTOR
RNAse : Ribonucléase rpS6 : ribosomal protein S6
RT-PCR : Reverse trancription-PCR
SCAP : SREBP cleavage-activating protein
SDS : Sodium dodécyl sulfate
SDS-PAGE : Sodium dodécyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis
SH2 : Src homology 2
Shc : Src homology and collagen protein
SRE : Sterol response element
SREBP : Sterol regulatory element binding protein
SRI : Séquence de réponse à l’insuline
TOR : Target of rapamycine
TSC1-TSC2 : Tuberous sclerosis complexe 1/2 ou Hémartine/Tubérine