Sujet thèse N. Leblond-Bourget Allocation  2009
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Sujet thèse N. Leblond-Bourget Allocation 2009

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Proposition de thèse Ecole doctorale : Ressources Procédés Produits Environnement – ED n°410 Laboratoire d’accueil : Génétique et Microbiologie, UMR UHP/INRA 1128 IFR 110 Faculté des Sciences et Techniques, Vandœuvre-lès-Nancy Directeur de Thèse : Nathalie Leblond-Bourget bourget@nancy.inra.fr ℡ 03 83 68 42 10 Durée de la Thèse : 3 ans Titre de la Thèse Caractérisation des mécanismes de signalisation et de réponse aux stress impliquant les régulateurs transcriptionnels Rgg de la bactérie industrielle Streptococcus thermophilus Contexte de la demande Streptococcus themophilus est une bactérie à fort potentiel industriel. Elle est employée dans les entreprises agroalimentaires comme ferment lactique pour la production de yaourts et de nombreux fromages. Au cours des procédés industriels, S. thermophilus est soumise à de brusques variations de son environnement. Pour continuer leur croissance, les bactéries adaptent leur physiologie et mettent en place des systèmes de protection contre ces agressions. Ces réponses nécessitent des réseaux complexes de régulations permettant l’ajustement du phénotype (métabolisme, morphologie) en réponse aux signaux de l’environnement. Parmi les régulateurs transcriptionels identifiés au sein des génomes de souches de S. thermophilus, deux appartenant à la famille multigénique rgg sont importants pour la survie des cellules en condition de stress oxydant (Fernandez et al., 2004 et 2006) . Le rôle de ces ...

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Proposition de thèse
Ecole doctorale : Ressources Procédés Produits Environnement – ED n°410
Laboratoire d’accueil :
Génétique et Microbiologie, UMR UHP/INRA 1128 IFR 110
Faculté des Sciences et Techniques, Vandoeuvre-lès-Nancy
Directeur de Thèse :
Nathalie Leblond-Bourget
bourget@nancy.inra.fr
03 83 68 42 10
Durée de la Thèse :
3 ans
Titre de la Thèse
Caractérisation des mécanismes de signalisation et de réponse aux stress impliquant les régulateurs
transcriptionnels Rgg de la bactérie industrielle
Streptococcus thermophilus
Contexte de la demande
Streptococcus themophilus
est une bactérie à fort potentiel industriel. Elle est employée dans les
entreprises agroalimentaires comme ferment lactique pour la production de yaourts et de nombreux
fromages.
Au cours des procédés industriels,
S. thermophilus
est soumise à de brusques variations de son
environnement. Pour continuer leur croissance, les bactéries adaptent leur physiologie et mettent en place
des systèmes de protection contre ces agressions. Ces réponses nécessitent des réseaux complexes de
régulations permettant l’ajustement du phénotype (métabolisme, morphologie) en réponse aux signaux de
l’environnement. Parmi les régulateurs transcriptionels identifiés au sein des génomes de souches de
S. thermophilus
, deux appartenant à la famille multigénique
rgg
sont importants pour la survie des cellules en
condition de stress oxydant (Fernandez
et al
., 2004 et 2006) . Le rôle de ces régulateurs est aussi étayé par
les données bibliographiques qui révèlent que les protéines Rgg des streptocoques pathogènes contrôlent
des gènes de nature très variée, souvent essentiels à la survie des cellules en conditions de stress et à la
colonisation de leurs hôtes (Chaussee et al., 2003 et 2004).
A l’échelle de la population bactérienne, un mécanisme permettant une réponse coordonnée des
individus qui la compose, basé sur l’augmentation de la densité cellulaire a été mis en évidence au sein de
plusieurs espèces bactériennes. Ce mécanisme de communication cellulaire, nommé « quorum sensing »,
consiste en l’émission dans le milieu extracellulaire de molécules de signalisation, qui sont captées par des
systèmes senseurs et dont la finalité est la modulation de l’expression de gènes permettant l’adaptation des
bactéries à leur environnement. L’hypothèse testée est que l’activation de protéines Rgg pourrait être
régulée par un mécanisme de « quorum sensing » (QS), médiée par l’émission dans le milieu extracellulaire
d’une molécule de signalisation, la phéromone Shp (Ibrahim
et al
, 2007).
Objectifs de la thèse et stratégies expérimentales
Une caractéristique remarquable des génomes de souches de
S. thermophilus
est la présence d’un grand
nombre de gènes
rgg
(6 à 7 gènes différents
contre un maximum de 2 chez les streptocoques
pathogènes). Ce fort nombre de gènes rgg suggère que leur acquisition et surtout leur maintien sont
avantageux pour
S. thermopihlus
.
Le premier objectif du travail de thèse est de déterminer parmi les 6 à 7 copies de gènes
rgg
présentes au sein des génomes de souches de
S. thermophilus
lesquelles sont impliquées dans la
réponse adaptative de
S. thermophilus
et à quel(s) stress elles répondent.
Afin de déterminer si les
différentes copies des gènes
rgg
de
S. thermophilus
ont des rôles analogues dans la cellule ou distincts, la
construction de simples mutants délétés de gènes
rgg
sera entreprise. Puis l'impact de ces délétions sur la
survie
S. thermophilus
dans différentes conditions environnementales et dans différentes phases de la
croissance bactérienne sera établi. Actuellement, 5 simples mutants présentant la délétion d’un des 5
gènes
rgg
ont été construits et leur analyse montre que l’un des gènes
rgg
(
rgg0182
) est nécessaire à la
survie de
S. thermophilus
en condition de stress thermique. La construction de mutants multiples est aussi
envisagée. Elle permettra de déterminer si ces gènes ont des fonctions indépendantes, redondantes ou
s’ils sont susceptibles d’interagir les uns avec les autres.
Si le rôle de régulateurs transcriptionnels des gènes
rgg
n’est plus remis en doute, leur mode d’action
est loin d'être clairement établi, et semble être complexe.
Le deuxième objectif de ce travail sera d’analyser les conditions d’expression de ces gènes
.
L’expression des gènes
rgg
sera mesurée dans les différentes phases de la croissance bactérienne et dans
différentes conditions environnementales (par RT-PCR en temps réelle). Ceci permettra de déterminer si
ces gènes sont constitutivement exprimés ou non et si leur niveau d’expression diffère d’un gène à l’autre,
et dans quelles conditions environnementales.
Les données de la littérature indiquent que chez les streptocoques pathogènes, plusieurs d'entre eux,
régulent positivement la transcription de gènes adjacents, d’autres régulent également des gènes qui leur
sont physiquement éloignés. Ainsi, les protéines Rgg peuvent agir directement sur leurs gènes cibles ou
encore via d’autres régulateurs transcriptionnels.
Le troisième objectif de ce travail consistera à
identifier les cibles des gènes
rgg
chez
S. thermophilus
.
Le séquençage complet des génomes de
S. thermophilus
LMG18311 et CNRZ1066 a permis le développement de puces à ADN et leur exploitation
au sein de l’unité de Génétique bactérienne (INRA de Jouy-en-Josas). Une collaboration incluant le LGM
et les unités de Biochimie Bactérienne (V. Monnet) et de Génétique bactérienne (P. Renault) a été initiée
dans l’optique d’identifier tous les gènes contrôlés par des régulateurs Rgg. L’accès à ces puces permettra
de tester le niveau global d'expression des gènes de
S. thermophilus
en absence d'un ou plusieurs gènes
rgg
et de le comparer au niveau d’expression dans le contexte sauvage. Une fois les cibles identifiées, leur
niveau d’expression dans un contexte sauvage et mutant pour
rgg
sera déterminé par PCR quantitative afin
de confirmer les résultats obtenus. Ce travail permettra l’identification des régulons
rgg
. Leur
caractérisation donnera accès aux processus cellulaires dans lesquels ils s’inscrivent. La comparaison des
régulons
rgg
nous permettra d’établir s’ils sont impliqués dans des réseaux de régulation analogues ou
différents et de déterminer les voies métaboliques régulées.
Quatre des sept gènes
rgg
de
S. thermophilus
LMG18311 sont flanqués d’un gène
shp
codant
potentiellement une phéromone. Cette molécule de signalisation pourrait agir directement avec la
protéine Rgg pour moduler son activité et donc l’expression de nombreux gènes en réponse à des
signaux de l’environnement.
Le dernier objectif de ce travail consistera à élucider au niveau
moléculaire le mécanisme de signalisation médié par les couples Shp/Rgg
. Pour ce faire une
collaboration a été établie avec V. Monnet et R. Gardan. La nature des interactions Shp/Rgg sera étudiée
ainsi que les interactions entre les protéines Rgg (en présence ou non du peptide Shp) et l’ADN.
Les collaborations
Unité de Biochimie Bactérienne, UR477, INRA, Centre de Recherches de Jouy-en-Josas, 78352
Jouy-en-Josas cedex
Unité Génétique Microbienne
. UR895, INRA, Centre de Recherches de Jouy-en-Josas, 78352 Jouy-en-
Josas cedex
UMR7565 Laboratoire Structure et Réactivité des Systèmes Moléculaires Complexes (LSRSMC)
CNRS Faculté de pharmacie – Nancy Université
Les connaissances et compétences requises
Le(a) candidat(e) aura une formation en biologie, des compétences en microbiologie et maitrisera les
concepts et les méthodologies en biologie moléculaire. Une forte aptitude au travail d’équipe est
souhaitée.
Références Bibliographiques
Chaussee, M.A., Callegari, E.A., and Chaussee, M.S. (2004).
J Bacteriol
186
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Chaussee, M.S., Somerville, G.A., Reitzer, L., and Musser, J.M. (2003)
J Bacteriol
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: 6016-6024.
Ibrahim, M., Guillot, A., Wessner, F., Algaron, F., Besset, C., Courtin, P., Gardan, R., and
Monnet, V. (2007)
J Bacteriol
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Ibrahim M, Nicolas P, Bessières P, Bolotin A, Monnet V, Gardan R. (2007)
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3631-44.
Publications de l’encadrant (2004-2009)
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mature septa to promote
S. thermophilus
cell separation. Molecular Microbiology, 71, 1205-1217
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S. Layec, B. Decaris et N. Leblond-Bourget. 2008. Diversity of the firmicutes peptidoglycan
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Fernandez, F. Borges, B. Gintz, B. Decaris, N. Leblond-Bourget. 2006. The
rggC
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F. Borges, S. Layec, A. Thibessard, A. Fernandez
, B. Gintz, P. Hols, B. Decaris, and N. Leblond-
Bourget. 2005.
cse
, a chimeric and variable gene, encodes an extracellular protein involved in
cellular segregation in
Streptococcus thermophilus
. Journal of Bacteriology, 2005, 187, 2737-2746.
A. Thibessard, F. Borges, A. Fernandez
, B. Gintz, B. Decaris and N. Leblond-Bourget. 2004.
Identification of
Streptococcus thermophilus
CNRZ368 genes involved in defense against superoxide
stress. Applied and Environmental Microbiology, 70, 2220-2229.
Fernandez, A. Thibessard, F. Borges
, B. Gintz, B. Decaris, and N. Leblond-Bourget. 2004.
Characterization of oxidative stress-resistant mutants of Streptococcus
thermophilus
CNRZ368.
Archives of microbiology, 182, 364-372.