Dominios de las neuregulinas implicados en su maduración, transporte a la membrana plasmática y acción biológica

Barrueco Rodríguez, Ruth

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Colecciones : CIC. Tesis del Centro de Investigación del Cáncer
Fecha de publicación : 20-ene-2009

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Extrait

Dominios de las neuregulinas implicados en su maduración, transporte a la membrana plasmática y acción biológica T ESIS D OCTORAL Ruth Rodríguez Barrueco Centro de Investigación del Cáncer Salamanca 2008

El Dr. A TANASIO P ANDIELLA A LONSO , Profesor de Investigación del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), CERTIFICA:

Que la memoria tituladaDominios de las neuregulinas implicados en su maduración, transporte a la membrana plasmática y acción biológica, presentada por la licenciada R UTH R ODRÍGUEZ B ARRUECO ha sido realizada bajo su dirección en el Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer (IBMCC) y reúne, a su juicio, originalidad y contenidos suficientes para que sea presentada ente el tribunal correspondiente y optar al grado de Doctora por la Universidad de Salamanca. Y para que así conste, expide el presente certificado en Salamanca a 20 de enero de 2009. Fdo. Dr. Atanasio Pandiella Alonso

Índice1

Índice Abreviaturas …………………………………………………………………………….… Introducción ……………………………………………………………………………….. 1. Receptores ErbB/HER ………………………………………………………………..

1.1. Estructura y activación de los receptores ErbB …………………………...

1.2. Receptores ErbB y cáncer ……………………………………………………..

1.2.1. EGFR ………………………………………………………………………..

1.2.2. ErbB2 ………………………………………………………………………..

1.2.3. ErbB3 ………………………………………………………………………..

1.2.4. ErbB4 ………………………………………………………………………..

1.3. Aproximaciones terapéuticas …………………………………………………

1.3.1. Anticuerpos monoclonales ………………………………………………..

1.3.2. Inhibidores de la actividad tirosina quinasa ………………………..……

2. Ligandos de la familia del EGF ……………………………………………………..

2.1. Especificidad de los ligandos de la familia del EGF ……………………..

2.2. Ligandos EGF y cáncer ………………………………………………………..

3. Neuregulinas ……………………………………………………………………………

3.1. Genes, expresión y función biológica ………………………………………..

3.1.1.NRG1……………………………………………………………………….. 3.1.2.NRG2……………………………………………………………………….. 3.1.3.NRG3……………………………………………………………………….. 3.1.4.NRG4………………………………………………………………………..

3.2. NRG1: Clasificación y dominios estructurales ……………………………. 3.2.1. Nterminal …………………………………………………………………... 3.2.2. DominioKringle ……………………………………………………………. 3.2.3. Dominio inmunoglobulina …………………………………………………. 3.2.4. Región espaciadora ……………………………………………………….. 3.2.5. Dominio Rico en Cisteínas (CRD) ……………………………………….. 3.2.6. Dominio EGF ……………………………………………………………….. 3.2.7. Región yuxtamembrana …………………………………………………... 3.2.8. Dominio transmembrana ………………………………………………….. 3.2.9. Cola citosòlica ………………………………………………………………

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13 14 15 20 20 21 23 24 25 25 26 29

30 32 33 34 36 38 39 39 40 40 41 42 43 43 44 45 45 46

2 Índice 3.3. Señalización ……………………………………………………………….. 3.3.1. Señalización a través de los receptores ErbB …………………………..

3.3.1.1. Activación de los receptores ……………………………………..

3.3.1.2. Cascada de señalización ………………………………………...

3.3.1.3. Efectos sobre la transcripción génica …………………………..

3.3.1.4. Señalización independiente de transcripción ………………….

3.3.2. Señalización independiente de receptores ErbB ……………………….

3.3.2.1. A través de la cola citoplasmática ……………………………....

3.3.2.1. Neuregulina nuclear ……………………………………………… 3.3.3. Regulación de los niveles de neuregulina ………………………………. 3.4. Papel de las neuregulinas en cáncer ……………………………………

Hipótesis y Objetivos Material y Métodos ………………………………………………………………………  1. Reactivos y animales de experimentación ……………………………………….

 2. Anticuerpos ……………………………………………………………………………...

2.1. Anticuerpos comerciales …………………………………………………………..

2.2. Anticuerpos generados en el laboratorio ………………………………………..

2.3. Producción de proteínas de fusión ……………………………………………….

2.4. Obtención de péptidos acoplados a KLH ………………………………………..

2.5. Obtención de antisueros …………………………………………………………..

2.6. Purificación de anticuerpos por cromatografía de afinidad ……………………

3. Cultivos celulares ………………………………………………………………..…….

3.1. Condiciones de cultivo …………………………………………………………….

3.2. Preservación de líneas celulares …………………………………………………

3.3. Transfección y selección de clones estables ……………………………………

 4. Generación de mutantes ……………………………………………………………..

 5. Electroforesis y Western Blot ………………………………………………………..

5.1. Extracción de proteínas e inmunoprecipitación …………………………………

5.2. Electroforesis en gel de poliacrilamida …………………………………………..

5.3. Western Blot ………………………………………………………………………..

 6. Inmunofluorescencia ………………………………………………………………….

49 49 49 52 53 54 55 55 55 55 57

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63 63 65 65 66 66 68 68 68 69 70 70 71 72 73 73 74 75 76

Índice3

 7. Citometría de flujo ……………………………………………………………………..

7.1. Marcaje de superficie ………………………………………………………………

7.2. Análisis de ciclo celular …………………………………………………………....

 8. Ensayo de protección de proteasas ……………………………………………….

 9. Fraccionamiento subcelular …………………………………………………………

10. Proliferación celular ……………………………………………………………………

11. Análisis estadístico ……………………………………………………………………. Resultados y Discusión ……………………………………………………………….

1. Formas moleculares de NRGα2c ………………………………………………….

1.1. Localización subcelular ……………………………………………………………

1.2. Modificaciones postraduccionales ……………………………………………….

2. Determinantes de la localización subcelular de NRGα2c .. …………………..

2.1. Actividad biológica de las formas solubles de NRGα2c ……………………….

2.2. Exposición de los mutantes de NRGα2c a la superficie celular ………………

2.3. Anclaje a la membrana de los mutantes de NRGα2c ………………………….

2.4. Topología y glicosilación de los mutantes de NRGα2c ………………………..

2.5. Péptido señal de TGFα ............................................................................................

3. Propiedades biológicas asociadas a los diferentes dominios de NRG ……

3.1. Mutantes retenidos en el interior de la célula …………………………………..

Δ Ig 3.2. Mutante NRG ……………………………………………………………………. Δ Ig 3.2.1. Actividad de la forma soluble de NRG ………………………………... Δ Ig 3.2.2. Actividad de la forma transmembrana de NRG ………………………

3.2.3. Actividad biológica de TGFα................................................................

Conclusiones ……………………………………………………………………………… Bibliografía …………………………………………………………………………………

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Abreviaturas5

Abreviaturas Abs Absorbance Absorbancia ADAM A Disintegrin and Metalloproteinase Desintegrina y Metaloproteinasa AG Aparato de Golgi ARIA Acetylcholine Receptor Inducing Activity Inductor del Receptor de Acetilcolina ATP Adenosine Triphosphate Trifosfato de Adenosín Bad Bcl2 Antagonist of Cell Death Antagonista de Bcl2 de Muerte Celular Bclx L Bcl2like 1 protein Proteína similar a Bcl2 1 BRCA Breast Cancer Type 1 Susceptibility Protein Proteína de Susceptibilidad al Cáncer de Mama de Tipo I BSA Bovine Serum Albumin Seroalbúmina Bovina CaMK Calcium/CalmodulinDependent Serine/ThreonineProtein Kinase 1 Quinasa de Serina/Treonina Dependiente de Calcio/Calmodulina 1 Cdk Cell Division Protein Kinase Proteina Quinasa de División Celular cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid Ácido Desoxiribonucleico Complementario CHO Chinese Hamster Ovary Ovario de Hámster Chino CHX Cyclohexymide Cicloheximida COPI Coat Protein I Proteína de Cubierta I COPII Coat Protein II Proteína de Cubierta II CRC Colorectal Cancer Cáncer Colorrectal CRD CysteinRich Domain Dominio Rico en Cisteínas 2+ CREB Response Element Binding ProteinCa /cAMP 2+ Proteína de Unión al Elemento de Respuesta a Ca /cAMP

6 Abreviaturas CYR61 Cysteinerich Angiogenic Inducer 61 Inductor 61de la Angiogénesis Rico en Cisteínas Da Dalton DAPI 4'6Diamidino2Phenylindole Diclorhidrato de 4',6Diamidino2Fenilindol DEPC Diethylpyrocarbonate Dietilpirocarbonato DG Diacylglycerol Diacilglicerol DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Medio de Eagle Modificado por Dulbecco DMSO Dimethyl Sulfoxide Dimetil Sulfóxido DNA Deoxyribonucleic Acid Ácido Desoxiribonucleico dNTP Deoxynucleotides Triphosphate Desoxinucleótidos Trifosfato D.O. Densidad Óptica DON1 Divergent of Neuregulin1 Divergente de Neuregulina1 DOX Doxycycline Doxiciclina 4EBP1 Eukaryotic Translation Initiation Factor 4EBinding Protein 1 Proteína de Union al Factor de Inicio de la Traducción 4E 1 EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid Ácido Etilendiaminotetraacético EGF Epidermal Growth Factor Factor de Crecimiento Epidérmico EGFR Epidermal Growth Factor Receptor Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico eIF4E EukaryoticTranslation Initiation Factor 4B Factor de Inicio de la Traducción Eucariota 4B CREB cAMP Response ElementBinding Protein Proteína de Unión al Elemento de Respuesta a AMP Cíclico EphB2 Ephrin TypeB Receptor 2 Receptor de Efrina de Tipo B 2 ErbB Erythroblastic Leukemia Viral Oncogene B Oncogén Viral de la Leucemia de Eritroblastosis B Erk1/2 Extracellular SignalRegulated Kinase1/2 Quinasa Regulada por Señales Extracelulares 1/2

Erk5

FACS

FAK

FITC

Flt1

Gab

GABP

GAPDH

GFP

GGF

GM130

GPCR

Grb

GST

H&N

HA

HBEGF

HDAC2

HEK

HEPES

Extracellular SignalRegulated Kinase5 Quinasa Regulada por Señales Extracelulares 5 Fluorescence Activated Cell Sorter Clasificación Celular por Fluorescencia Focal Adhesion Kinase Quinasa de Adhesiones Focales Fluorescein Isothiocyanate Isotiocianato de Fluoresceína Fmslike Tyrosine Kinase 1 Tirosina Quinasa Similar a Fms1 GRB2AssociatedBinding Protein Proteína de Unión Asociada a GRB2 Growth AssociatedBinding Protein Proteína de Unión Asociada al Crecimiento Glyceraldehyde 3Phosphate Dehydrogenase Gliceraldehido 3Fosfato Deshidrogenasa Green Fluorescent Protein Proteína Verde Fluorescente Glial Growth Factor Factor de Crecimiento Glial Golgi Matrix Protein of 130 kDa Proteína de 130 kDa de la Matriz del Golgi GProteinCoupled Receptor Receptor Asociado a Proteína G Growth Factor ReceptorBound Protein Proteína Unida a Receptor de Factor de Crecimiento GlutationSTransferase GlutatiónSTransferasa Head and Neck Cabeza y Cuello Haemaglutinin Hemaglutinina Heparin Binding Epidermal Growth Factor Factor de Crecimiento Epidérmico de Unión a Heparina Histona Deacetilasa 2 Histona Deacetilasa 2 Human Embrionary Kidney Riñón Embrionario Humano 4(2Hydroxyethyl)1Piperazineethanesulfonic Acid Ácido 4(2Hidroxietil)1Piperazineetanosulfónico

Abreviaturas7

8 Abreviaturas HER Human Epidermal Growth Factor Receptor Receptor del Factor Epidérmico Humano HGF Hepatocyte Growth Factor Factor de Crecimiento de Hepatocitos HIF1α HypoxiaInducible Factor 1α Factor Inducible por Hipoxia 1α HRP Horseradish Peroxidase Peroxidasa de Rábano Hsp70 Heat Shock Protein 70 Proteína de Choque Térmico 70 hUBC9 Human Ubiquitin Carrier Protein 9 Proteína Humana Transportadora de Ubiquitina 9 Ig Immunoglobulin Inmunoglobulina IHQ Immunohistochemistry Inmunohistoquímica IP Immunoprecipitation Inmunoprecipitación IP 3 Inositol Triphosphate Trifosfato de Inositol IPTG IsopropylßDThiogalactopyranoside Isopropilβ−DTiogalactopiranósido KGF Keratinocyte Growth Factor Factor de Crecimiento de Queratinocitos KLH Keyhole Limpet Hemocyanin Hemocianina de Lapa KRH Krebs Ringer Hepes mAb Monoclonal Antibody Anticuerpo Monoclonal MAPK Mitogen Activated Protein Kinase Proteína Quinasa Activada por Mitógenos MBS 3Maleimidobenzoic Acid NHydroxysuccinimide Ester NHidroxisuccinamida del Ácido mMaleimidobenzoico MCSS Medio de Cultivo Sin Suero MEK MeiosisSpecific Serine/ThreonineProtein Kinase Proteína Quinasa de Serina/Treonina Específica de Meiosis MEKK MeiosisSpecific Serine/ThreonineProtein Kinase Kinase Proteína Quinasa de la Quinasa de Serina/Treonina Específica de Meiosis MMLVRT Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase Transcriptasa Reversa del Virus de la Leucemia Murina de Moloney