Structure and dynamics of fluorophore labelled DNA helices probed by NMR-spectroscopy [Elektronische Ressource] / von André Dallmann

Dipl.-Chem. André Dallmann

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• Publié le: 01 janvier 2009
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• Langue: English
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Extrait

Structure and dynamics of fluorophore-labelled DNA
helices probed by NMR-spectroscopy
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
Dr. rer. nat.
im Fach Chemie
eingereicht an der
Mathematisch-Wissenschaftlichen Fakultät I
Humboldt-Universität zu Berlin
von
Dipl.-Chem. André Dallmann
19.09.1980 in Berlin
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin:
Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies
Dekan der Mathematisch-Wissenschaftlichen Fakultät I:
Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön
Gutachter:
1. Prof. Nikolaus P. Ernsting
2. Prof. Christian Griesinger
3. Prof. Clemens Mügge
eingereicht am: 28.10.2009
Tag der mündlichen Prüfung: 18.12.2009To my wife
Your love and support wrote this thesisAbstract
Structural and dynamic perturbations in DNA upon incorporation of either fluo-
rophore, 2-Aminopurine (2AP) or 2-Hydroxy-7-nitrofluorene (HNF), are character-
ized by NMR spectroscopy. For this purpose the NMR solution structures of the
modified DNA duplexes with the sequence 5’-GCTGCAXACGTCG-3’ are solved.
For X=2AP (13mer2AP) the partner base in the complementary strand is T, while
for X=HNF (13merHNF) an abasic site is introduced to avoid steric strain.
By comparing results on 13mer2AP with the corresponding unmodified DNA du-
plex (13merRef, X=A), any perturbation can be unambiguously assigned to 2AP
incorporation. For the NMR solution structure of 13merRef and 13mer2AP small
but significant changes in helical parameters are found throughout the helix. Imino
proton exchange measurements reveal an extended, distributed effect of 2AP incor-
poration on the lifetimes of the central seven base pair. However, the reduced base
pair lifetime of 2AP:T cannot fully account for the rapid water exchange observed
with saturation transfer experiments in the absence of base catalyst. This indicates
enhanced intrinsic catalysis. As a possible catalytic site the T O4 atom opposite
2AP is discussed, which is easily accessible through the major groove and lacks a
hydrogen bonding partner within the base pair.
The overall NMR solution structure is found to be B-DNA. However the NOE
cross-peaks involving the HNF residue can only be accounted for by two different
orientations of the HNF inside the DNA helical stack. Their population ratio is
estimated to be 1:1. Dynamical perturbation is indicated by the increased linewidth
and strong upfield shift of the T residue to the 5’-side of the abasic site.
vZusammenfassung
Mittels NMR-Spektroskopie werden Störungen in Struktur und Dynamik von
DNA untersucht, die durch den Einbau jeweils eines der beiden Fluorophore 2-
Aminopurin (2AP) und 2-Hydroxy-7-nitrofluoren (HNF) hervorgerufen werden. Zu
diesem Zweck werden die NMR-Strukturen der modifizierten Duplexe mit der Se-
quenz 5’-GCTGCAXACGTCG-3’ berechnet. Im Fall X=2AP (13mer2AP) ist die
Partnerbase im Komplementärstrang ein T, während gegenüber X=HNF (13mer-
HNF) eine abasische Stelle eingeführt wird.
Durch den Vergleich der Ergebnisse zum 13mer2AP mit denjenigen des entspre-
chendenunmodifiziertenDNADoppelstranges(13merRef,X=A)konntejeglicheÄn-
derung eindeutig dem Einbau von 2AP zugordnet werden. Für die NMR-Strukturen
von13merRefund13mer2APkönnenkleineabersignifikante,überdiegesamteHelix
verteilteStrukturstörungennachgewiesenwerden.ExperimentezumIminoprotonen-
austausch mit Wasser ergeben, daß der Einbau von 2AP die Basenpaarlebensdauern
der 7 zentralen Basenpaare erniedrigt. Die kürzere Lebensdauer des 2AP:T Ba-
senpaares kann jedoch nicht den schnellen Wasseraustausch im Sättigungstransfer-
Experiment ohne Zugabe von Basenkatalysator erklären. Als Erklärung für diese
Diskrepanz wird eine effizientere intrinsische Katalyse vermutet. Als mögliche, kata-
lytisch aktive Stelle wird das T O4 Atom diskutiert, welches über die große Furche
leicht zugänglich ist und das keine Wasserstoffbrückenbindung innerhalb des Basen-
paares ausbilden kann.
Die übergeordnete Struktur des 13merHNF ist eine B-Form DNA Helix. Die NOE
Kreuzpeaks zu den Protonen im HNF können jedoch nur durch zwei verschiede-
ne Orientierungen des HNFs in der helikalen Anordnung beschrieben werden. Das
Verhältnis der beiden Orientierungen untereinander wird als 1:1 abgeschätzt. Stö-
rungen in der Basenpaardynamik werden durch die höhere Linienbreite und die
starke Hochfeldverschiebung des T auf der 5’-Seite ausgehend von der abasischen
Stelle angedeutet.
viiInhaltsverzeichnis
1 Introduction 1
2 Theoretical background 7
2.1 Structural aspects of DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.2 Base pair dynamics in DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.2.1 Imino proton exchange theory . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.2.2 Inversion recovery experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.3 Solution structure determination of DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.3.1 Nuclear Overhauser Effect spectroscopy . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.3.2 Structural information from Nuclear Overhauser Enhancement ef-
fects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3.3 Residual Dipolar Couplings . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.3.4 Simulated Annealing calculations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3 Experimental details 39
3.1 2-Aminopurine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.1.1 Sample preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.1.2 Measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.1.3 Restraint generation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.1.4 Structure calculation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
3.2 2-Hydroxy-7-nitrofluorene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
3.2.1 Sample preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
3.2.2 Measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.2.3 Restraint generation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.2.4 Structure calculation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
4 Results and discussion 57
ixInhaltsverzeichnis
4.1 2-Aminopurine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
4.1.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
4.1.2 Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
4.1.2.1 Chemical shift analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
4.1.2.2 Structural comparison . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
4.1.2.3 Comparison of base pair dynamics . . . . . . . . . . . . . 71
4.1.2.4 of duplex melting . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.1.3 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
4.2 2-Hydroxy-7nitrofluorene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
4.2.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
4.2.2 Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
4.2.2.1 Chemical shift analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
4.2.2.2 NMR solution structure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
4.2.2.3 Duplex melting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
4.2.3 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
Summary 99
Zusammenfassung 101
Script code 147
.1 Force field parameter and topology files . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
.2 Xplor-NIH calculation input files . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196
.3 c restraints files and structures . . . . . . . . . . . . 212
.4 Lua scripts written for data export from CARA . . . . . . . . . . . . . . . 212
.5 Utility scripts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253
Chemical shifts 261
.6 Chemical shifts of 13merHNF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261
.7 shifts of 13merRefGC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 265
.8 Chemical shifts of 13merRef . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267
.9 shifts of 13mer2AP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270
.10 Chemical shift differences for 13merRef and 13mer2AP . . . . . . . . . . . 273
Helical parameter 275
x