Structure, fluidity and phase behavior of supported lipid membranes [Elektronische Ressource] : an investigation by X-ray reflectivity and fluorescence microscopy / vorgelegt von Christian Reich

Reich Christian

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• Physik

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• Publié le: 01 janvier 2007
• Nombre de lectures: 16
• Langue: English
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Extrait

Structure, Fluidity and Phase Behavior
of Supported Lipid Membranes:
An Investigation by X-ray Reflectivity and
Fluorescence Microscopy

Christian Reich




Department für Physik
Ludwig-Maximilians-Universität

München, Mai 2007







Structure, Fluidity and Phase Behavior
of Supported Lipid Membranes:
An Investigation by X-ray Reflectivity and
Fluorescence Microscopy





Dissertation
der Fakultät für Physik
der Ludwig-Maximilians-Universität


vorgelegt von
Christian Reich
aus Kronstadt in Siebenbürgen / Rumänien

München, 29. Mai 2007

LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITÄT MÜNCHEN





















Erstgutachter: Prof. Dr. Joachim O. Rädler
Zweitgutachter: Prof. Dr. Thomas Bein
Tag der mündlichen Prüfung: 31. Juli 2007

Contents
Zusammenfassung iii
Summary vii
1 Introduction 1
2 Amicrofluidicsetupforstudiesofsolid-liquidinterfacesusingX-ray
reflectivity and fluorescence microscopy 5
2.1 X-ray reflectivity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.2 Fluorescence microscopy at the synchrotron . . . . . . . . . . . . . 10
2.3 Quantitative fluorescence microscopy: Continuous bleaching . . . . 11
2.4 Membrane preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
3 Supported lipid membranes on polymer substrates 17
3.1 Lipid membranes on a thermoplastic substrate . . . . . . . . . . . 18
3.2 Lipidranes on dielectric polymer multilayers . . . . . . . . . 21
4 Structure and dynamics of crystalline protein layers bound to sup-
ported lipid bilayers 25
5 Condensation, stretching and asymmetry: G and cholesterol inM1
single supported lipid bilayers 31
A Publications 39
A.1 Full text of Ref. [1] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
A.2 Full text of Ref. [2] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
A.3 Full text of Ref. [3] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
A.4 Full text of Ref. [4] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
A.5 Full text of Ref. [5] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
B Continuous bleaching: Data evaluation and program description 109
Bibliography 115ii InhaltsverzeichnisZusammenfassung iii
Zusammenfassung
Die Zellmembranen von S¨augetieren haben eine hochgradig heterogene Struk-
tur und bestehen aus einer Vielzahl von Lipidmolekul¨en und Proteinen, die in
der zellul¨aren Lipiddoppelschicht angeordnet sind. Ein Verst¨andnis von Mem-
branprozessen, wie z.B. Lipid-Protein Wechselwirkungen, erfordert einen Einblick
˚in die molekulare Struktur der Zellmembran. Solche Angstrøm-Aufl¨osung wird
erm¨oglicht durch R¨ontgenstreutechniken, die auf die Elektronendichteverteilung
in Makromolekul¨en sensitiv sind. Modell-Lipidmembranen imitieren die Zusam-
mensetzung von naturlic¨ hen Zellmembranen und werden fur¨ Forschungszwecke be-
nutzt. Eine besondere Klasse von biomimetischen Lipidmembranen sind substrat-
gestutz¨ te Lipiddoppelschichten, die mit oberfl¨achensensitiver R¨ontgenreflektivit¨at
studiertwerdenk¨onnen. HochgradigbrillianteR¨ontgenstrahlenvonmodernenSyn-
˚chrotronquellen erm¨oglichen detaillierte Strukturuntersuchungen auf Angstrøm-
Skala von Lipiddoppelschichten an fest-flu¨ssig Grenzfl¨achen.
Fur¨ diese Doktorarbeit wurde ein neuartiger Aufbau zur Studie von einzelnen
biomimetischen Lipidmembranen an fest-flu¨ssig Grenzfl¨achen anhand von Reflek-
tivit¨at mit R¨ontgenstrahlen entwickelt. Der Aufbau ist ausserdem fur¨ quantitative
Fluoreszenzmikroskopie ausgerichtet und erlaubt es, die Strukturforschungen mit
Mikroskopiestudien zur Lipiddynamik in der Lipiddoppelschicht zu komplettieren.
Dieses Konzept wendet zwei experimentelle Charakterisierungstechniquen auf eine
einzelne Probe an und erlaubt einen ganzheitlichen Blick auf die biophysikalis-
chen Eigenschaften von biomimetischen Lipidmembranen, wie molekulare Struk-
tur, Lipidfluidit¨at und Phasenzustand der Lipiddoppelschicht.
Zun¨achst wurden Lipiddoppelschichten auf verschiedenen Substraten charakter-
isiert, um die Eignung solcher Membran-Grenzfl¨achen-Systeme fur¨ biologische und
biotechnologische Anwendungen bewerten zu k¨onnen. Die Oberfl¨achenchemie
eines zugrundeliegenden Substrats kann die strukturellen und dynamischen Eigen-
schaften einer Lipidmembran betr¨achtlich beeinflussen. Die Materialeigenschaften
des thermoplastischen Kunststoffs 2-norbornene ethylene (Topas), wie optische
Transparenz, hohe chemische Best¨andigkeit und Moglich¨ keiten fur¨ laterale Struk-
turierung, machen diese Verbindung zu einem interessanten Substrat fur¨ Lipid-
membranen. Lipiddoppelschichten auf Topas zeigten eine hohe Homogenit¨at, aber
auch eine reduzierte Lipidfluidit¨at (∼50 %) im Vergleich zu Lipiddoppelschichten
auf hydrophilem Siliziumoxid. Auf Topas wurde eine um 20 % reduzierte Dop-
pelschichtdicke gemessen, welche auf eine Doppelschichtkonformation mit en-
tweder aufgewickelten oder ineinander verflochtenen Alkylketten zuruckgef¨ u¨hrt
werden kann. Eine weitere Vorlage fur¨ biosensorische Anwendungen sind Mul-
tischichten aus Polyelektrolyten, welche als Dielektrikum zwischen Lipidmembra-
nen und Halbleitersubstraten fungieren k¨onnen, wie z.B. silicon-on-insulator Bau-
gruppen (SOI). Homogene Lipiddoppelschichten auf alternierenden Polyanion- und
Polykation Schichten wurden untersucht und die Welligkeit der Doppelschicht iniv Zusammenfassung
Abh¨angigkeit von der Anzahl der unterliegenden Polyelektrolytschichten charakter-
isiert.
Des weiteren wurde untersucht wie membrangebundene Proteine und Rezeptor-
moleku¨le die Membranstruktur und Lipidfluidit¨at beeinflussen. Die Bindung des
Proteins Streptavidin an Biotinmolekul¨e hat eine starke nichtkovalente Affinit¨at
und wird weitreichend in biotechnologischer Forschung angewendet. Die Bildung
einer Streptavidin/Avidin Schicht auf einer substratgestu¨tzten Lipiddoppelschicht
mit biotinylierten Lipiden wurde charakterisiert. Eine wohldefinierte Wasserschicht
˚von 8 A konnte aufgel¨ost werden, welche das Protein von der Lipiddoppelschicht
separiert; des weiteren wurde kein Einfluss des Proteins auf die Doppelschicht-
struktur beobachtet. Die Lipidfluidit¨at wurde anhand kontinuierlichen Bleichens
vorund nach derProteinbindungquantifiziertund einekleine MinderungderLipid-
diffusionskonstante um 10-15 % nach der Proteinbindung wurde beobachtet. Die
separierende Wasserschicht erm¨oglicht es offenbar der Lipiddoppelschicht ihre lat-
erale Fluidit¨at und strukturelle Integrit¨at zu bewahren.
Zum Abschluss wurden biomimetische Membranen mit komplexen Mixturen un-
tersucht, welche n¨aherungsweise mit der Lipidkomposition von Zellmembranen in
S¨augetieren u¨bereinstimmen. Bei diesen Lipidmembranen mit vielfachen Kompo-
nenten einschliesslich Cholesterin k¨onnen sich kondensierte und nicht-kondensierte
Lipidphasen auftrennen. Kondensierte Lipiddom¨anen haben eine h¨ohere Ordnung
als ihre Umgebung und lokalisieren Membranrezeptoren. Der Membranrezeptor
G ganglioside wurde in substratgestut¨ zten Lipiddoppelschichten mit CholesterinM1
und tern¨arer Komposition untersucht; es wurde Membrankondensation beobachtet
die durch die Pr¨asenz des Rezeptors ausgel¨ost wurde. Anhand der hohen struk-
turellen Auflo¨sung von Synchrotronreflektivit¨at wurde bestimmt, dass diese rezep-
torinduzierte Kondensation asymmetrisch sein kann und auf die Lipideinzelschicht
beschr¨ankt ist, in welcher G anwesend ist. Die Membranfluidit¨at wurde durchM1
die Pr¨asenz von G signifikant reduziert (∼50 %) und laterale Segregation inM1
mikroskopischeDom¨anen(∼5μm)wurdemitFluoreszenzmikroskopiebeobachtet.
In dieser Doktorarbeit wurden komplement¨are experimentelle Methoden angewen-
˚det um die Struktur von biomimetischen Lipidmembranen auf Angstrøm-Skala
und ihre Diffusionseigenschaften zu untersuchen. Systematische Studien wurden
durchgefuhrt¨ um den Einfluss von der Substratchemie, lipidgebundenen Makro-
moleku¨len und der Lipidanordnung auf die Struktur und die Fluidit¨at von Lipid-
doppelschichtenzuerfassenundzuquantifizieren. DervorliegendeMikrofluidikauf-
bau kann verwendet werden um andere komplexe Lipidmembransysteme zu unter-
suchen, mit dem Ziel unser physikalisches Verst¨andnis von der Lipidmembran-
Grenz߬ache zu verbessern.Summary v
Summary
The structure of mammalian cell membranes is highly heterogeneous and consists
of numerous lipid and protein molecules, which are organized into the cellular lipid
bilayer. Understanding membrane processes such as lipid-protein interactions re-
quiresaninsightintothemolecularstructureofthecellmembrane. Such˚angstrøm
resolution is offered by X-ray diffraction techniques, which are sensitive to