Studies on the late rhodopsin activation steps [Elektronische Ressource] / von Bernhard Knierim

Bernhard Knierim

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• Publié par: humboldt-universitat_zu_berlin
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 29
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 4 Mo

Extrait

Studies on the Late Rhodopsin Activation Steps
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biophysik
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von
Dipl.-Biophys. Bernhard Knierim
geboren in Bad Hersfeld am 1.12.1978
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Christoph Markschies
Dekan/Dekanin der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Christian Limberg
GutachterInnen: 1. Prof. Dr. Klaus-Peter Hofmann
2. Prof. Dr. Andreas Herrmann
3. Prof. Dr. Annette Beck-Sickinger
Tag der mündlichen Prüfung: 12.3.2008
8.10.2007 1
Abstract in German
Rhodopsin ist der Photorezeptor der Stäbchenzellen in der Retina von Vertebraten und wird als
Prototyp für die gesamte Gruppe der GPCRs (= G-Protein gekoppelte Rezeptoren) beforscht,
deren gemeinsames Merkmal der Aufbau aus sieben transmembranen Helices ist. Trifft ein Pho-
ton auf das Protein, so wird der über eine Schiffbase kovalent gebundene Chromophor Retinal
von seiner 11-cis- in die All-trans-Konfiguration isomerisiert und setzt infolgedessen den Akti-
vierungsprozess in Gang. Dieser mündet in der aktiven Rezeptorkonformation, die das G-Protein
Transducin aktivieren kann und dadurch eine Kaskade von weiteren Aktivierungsschritten ein-
leitet, die letztlich ein Nervensignal verursachen.
Das Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der späten Aktivierungsschritte und ihrer Ursache-
Wirkungs-Beziehungen. Zu diesem Zweck wurden Blitzlichtphotolyse, Elektronenspinresonanz
(EPR) mit ortsgerichteter Mutagenese und Spinlabeling (SDSL), UV/vis-Spektroskopie, FTIR-
Spektroskopie und Fluoreszenzspektroskopie angewandt. Kinetische Messungen wurden unter
identischen Bedingungen durchgeführt, um die Abfolge der mit den unterschiedlichen Techniken
zugänglichen Aktivierungsschritte aufzuklären.
Nach der Bildung des absorptionsspektroskopisch definierten Metarhodopsin-II-Zustands (Me-
ta-II) bewegt sich die Helix TM6 in einem späteren Schritt als ganzes nach außen und markiert
damit den Übergang von Meta-IIa zu Meta-IIb. Dadurch wird die in der ganzen Rezeptorgruppe
konservierte und bis dahin in der Membran verborgene D(E)RY-Region für das Umgebungsme-
+
dium zugänglich und nimmt ohne Zeitverzögerung ein Proton auf, wodurch der Meta-IIb H -
Zustand gebildet wird.
Das in der Rezeptorgruppe hochkonservierte D(E)RY-Motiv spielt eine doppelte Rolle – sowohl
bei der Stabilisierung der TM6-Position als auch bei der Aktivierung des Transducins. Die Stabi-
lisierung erfolgt insbesondere durch eine Wasserstoffbrücke zwischen dem D(E)RY-Motiv in
247Helix TM3 und dem Residuum Glu in Helix TM6, die wiederum durch eine Salzbrücke zwi-
134 135
schen Glu und Arg im D(E)RY-Motiv ermöglicht wird. In der nativen Membranumgebung
scheint im inaktiven Zustand ein Phosphatidylserinmolekül an das Motiv zu binden und könnte
so ebenfalls zur Stabilisierung beitragen. Ein weiteres konserviertes und für die Aktivierung
zentrales Motiv, das NPxxY(x) F-Motiv am Übergang zwischen der Helix TM7 und der zur 5,6
Membranoberfläche parallelen Helix H8, ist mit dem D(E)RY-Motiv schwach verbunden. Auch
in dieser Region findet eine strukturelle Änderung statt, allerdings mit einer von TM6 unabhän-
gigen Kinetik.
Die verfügbaren Daten sprechen dafür, dass das D(E)RY-Motiv bei der Aktivierung des Trans-
ducins sowohl die - als auch die -Untereinheit desselben bindet. Die Bindung von zu Transdu-
cin-Abschnitten analogen Peptiden kann dann erfolgen, wenn die Helix TM6 im nach außen be-
wegten Zustand ist, und führt zur Abgabe von bis zu zwei Protonen vom aktivierten Rhodopsin.
Sowohl das D(E)RY- und das NPxxY(x) F-Motiv als auch die beiden Zustände Meta-IIb und 5,6
+Meta-IIb H könnten relevant für den sequenziellen Transducin-Aktivierungsmechanismus sein.
D?J? 2
Abstract in English
Rhodopsin is the photoreceptor in the rod cells of the vertebrate retina. It is considered as a pro-
totype of the whole group of GPCRs (= G protein couplec receptors), whose common feature is
the composition of seven transmembrane helices. Upon absorption of a photon the chromophore
retinal, which is covalently bound through a Schiff base, is isomerized from its 11-cis into the
all-trans configuration. This initiates the activation process and finally results in the active re-
ceptor conformation which is capable of activating the G protein transducin and thereby triggers
a cascade of further activation steps which finally cause a nerve signal.
The aim of this work was the clarification of the late activation steps and their cause-and-effect
chain. For this purpose flash photolysis, electron paramagnetic resonance (EPR) with site-
directed mutagenesis and spin labeling (SDSL), UV/vis spectroscopy, FTIR spectroscopy and
fluorescence spectroscopy were applied. Kinetic measurements were executed under identical
conditions in order to elucidate the sequence of activation steps, which are accessible with the
different techniques.
After formation of the spectroscopically defined Metarhodopsin-II (Meta-II) state helix TM6
moves outward as a rigid body, thereby marking the transition from Meta-IIa to Meta-IIb. There-
fore the D(E)RY region, which is conserved throughout the whole receptor group and until then
buried in the membrane, gets accessible to the surrounding solution. It consequently takes up a
+proton without delay, thus forming the Meta-IIb H state.
The D(E)RY motif, which is highly conserved in this group of receptors, plays a double role –
both for stabilization of the inward TM6 state and for activation of transducin. The stabilization
especially results from a hydrogen bond between the D(E)RY motif in helix TM3 and the resi-
247 134 135due Glu in helix TM6. This bond is itself enabled by a salt bridge between Glu and Arg
in the D(E)RY motif. In the native membrane environment a phostphatidylserine molecule ap-
pears to bind to the motif in the inactive state and could thus also be involved in stabilization. A
further conserved motif which is central for activation is the NPxxY(x) F motif at the interface 5,6
between helix TM7 and helix H8, which is a helix parallel to the membrane. It is weakly con-
nected to the D(E)RY motif. In this region another structural transition occurs, though with ki-
netics which are independent of TM6.
Available data argue for the D(E)RY motif binding both the and the subunit of transducin
during activation of the latter. The binding of peptides which are analogous to sections of trans-
ducin is possible when helix TM6 is in the outward position. It causes the release of up to two
protons from the activated rhodopsin. Both the D(E)RY motif and the NPxxY(x) F motif as 5,6
+well as both the states Meta-IIb and Meta-IIb H are potentially relevant for the sequential trans-
ducin activation mechanism.
JD?? 3
Contents
Abstract in German ...................................................................................................................... 1
Abstract in English........................................................................................................................ 2
List of figures ................................................................................................................................. 7
List of tables................................................................................................................................. 10
Abbreviations............................................................................................................................... 11
Acknowledgments........ 13
Published journal articles........................................................................................................... 14
Poster presentations .................................................................................................................... 14
1 Introduction ......................................................................................................................... 15
1.1 Rhodopsin and the visual cascade................................................................................. 15
1.1.1 Location of rhodopsin ........................................................................................... 15
1.1.2 Protein family........................................................................................................16
1.1.3 Molecular structure of rhodopsin..........................................................................
1.1.4 Light activation of rhodopsin ................................................................................ 19
1.1.5 Signal transduction................................................................................................21
1.1.6 Deactivation..........................................................................................................
1.1.7 Blue light state....................................................................................................... 22
1.2 Flash photolysis........................................................................................................