Study the possible mechanisms of plant growth promotion by wheat diazotrophic bacteria grown in Uzbekistan soil [Elektronische Ressource] / Dilafruz Juraeva. Gutachter: Eckhard George ; Silke Ruppel

Dilafruz Juraeva

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• Publié le: 01 janvier 2011
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• Langue: English

Extrait

Humboldt Universität zu Berlin




Dissertation

Study the possible mechanisms of plant growth
promotion by wheat diazotrophic bacteria grown
in Uzbekistan soil


Zur Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum agriculturarum
(Dr. rer. agr.)


eingereicht an der
Landwirtschaftlich-Gärtnerischen Fakultät
der Humboldt-Universität zu Berlin


von

M.Sc. Genet. Dilafruz Juraeva



Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Christoph Markschies

Dekan der Landwirtschaftlich-Gärtnerischen Fakultät
Prof. Dr. Dr. h.c. Otto Kaufmann



Gutachter:
1. Prof. Dr. Eckhard George
2. Dr. Silke Ruppel

Tag der mündlichen Prüfung: 25.11.2009










































ii
Abstract

Plant growth promoting bacteria (PGPB) are ubiquitous in both plant root and shoot, and are important
contributors to the nitrogen-input of plants exerting their positive effects on plant growth directly or
indirectly through different mechanisms. The present work focuses on a) the isolation of PGPB, which
promotes the growth of different plant cultures and controls plant diseases caused by Fusarium species,
b) the prospects of PGPB to solve plant nutritional problems, c) developing new molecular methods for
the assessment of their diversity and activity.
A total of 780 bacterial strains were isolated from root, rhizosphere and phyllosphere of wheat grown in
soil Syrdarya and were tested for their ability to promote the growth of other plants resulting in several
universal PGPB strains.
Contributions of PGPB to plant nutrition were investigated with wheat, and several vegetable plants
such as cucumber, tomato, paprika, and cauliflower on quartz-sand substrates. Bacterial colonization,
plant dry weight, and N concentrations in plants were measured.
Bacterial inoculation effects on plant N nutrition in cucumber and tomato plants were determined by
4+ 3-exposing bacterial and non bacterial plants to two, low and high NH NO supply.
In the frame of this thesis, the methods for the description of the diversity of root colonizing PGPB have
been developed and improved to provide links between introduced PGPB abundance and activities. The
approach used was based on the sensitive real – time PCR detection/quantification of introduced PGBP
and the nitrogenase reductase gene (nifH), which served as a marker gene for potential diazotrophs.
The amplified 16S-23S ISR sequences of studied bacteria were subjected to strain – specific primer
design and a highly specific bacteria quantification protocol were developed. The bacteria quantification
protocol was based on real – time PCR using strain specific primers in order to evaluate the colonization
ability of studied bacteria, which were inoculated to plant roots.
The application previously used universal nifH primers to the real – time PCR improved the detection of
less abundant diazotrophs in dry land plant root. The protocols were tested and optimized using pure
cultures of diazotroph reference strains, and subsequently applied to the analysis of two vegetable plant
roots. Real – time analyses of PCR products obtained from plant root DNA extracts revealed that the
new nifH PCR protocol differentiated between the diazotroph populations in different plants.
The developed methodology was applied to study nifH abundance of Bacillus licheniformis and
Xanthomonas sp. inoculated to cucumber and tomato growing in non – sterile quartz sand. Treatments
with nitrogen limiting conditions resulted in more diazotrophic bacteria abundance, as well as, nifH gene
pool while nitrogen excess suppressed diazotrophic bacteria abundance in both inoculated and non-
inoculated plants. Furthermore, the nifH gene abundance was significantly correlated with
measurements of N amount taken by the plant and inoculated bacteria density showing direct
contribution of introduced bacteria to plant N nutrition. The results presented in this thesis have shown
that monitoring of nifH amount in plant root is a suitable and promising approach to link inoculated
diazotrophic bacteria abundance and its potential activity. The study of nifH gene abundance in plant
offers the opportunity to identify key players in asymbiotic nitrogen fixation, to study short-term
community responses in changing environments, or to analyze the effect of regulation in situ.


Keywords

16S-23S ISR quantification – asymbiotic diazotrophic bacteria – cauliflower – cucumber – nifH gene
quantification – nitrogen uptake – paprika – real-time PCR – tomato – wheat






iii
Inhaltsangabe

Das Pflanzenwachstum fördernde Bakterien (PGPB) kommen ubiquitär sowohl an der Wurzel als auch
am Spross der Pflanzen vor und sie können über direkte oder indirekte Mechanismen einen bedeutenden
Beitrag zur Stickstoffernährung der Pflanzen leisten. Die vorliegende Arbeit umfasst a) die Isolierung
von PGPB, welche das Wachstum verschiedener Pflanzenarten fördern und durch Fusarien verursachte
Pflanzenkrankheiten bekämpfen, b) die Analyse der Möglichkeiten Probleme der Pflanzenernährung
durch den Einsatz von PGPB zu lösen, c) die Entwicklung neuer molekularbiologischer Methoden zur
Messung der Diversität und Aktivität der PGPB.
780 Bakterienstämme wurden aus der Wurzel, der Rhizosphäre und Phyllosphäre von Weizen, der auf
Boden der Syrdarya wuchs, isoliert. Daraus wurden universelle PGPB Stämme ausgewählt, die das
Wachstum verschiedenster Pflanzen förderten. Der Beitrag dieser PGPB zur Pflanzenernährung wurde
an Weizen und verschiedenen Gemüsepflanzen, wie Gurke, Tomate, Paprika und Blumenkohl in
Quarzsand Modellversuchen analysiert. Bakterienbesiedlung der Pflanzen, Pflanzen Trockenmasse und
N-Konzentration in den Pflanzen wurden gemessen und bewertet.
Der Bakterieneinfluß auf die pflanzliche N-Ernährung von Gurke und Tomate wurde bei geringer und
hoher NH NO Versorgung an mit Bakterien inokulierten Pflanzen und nicht inokulierten 4 3
Kontrollpflanzen analysiert.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Methoden zur Beschreibung der Diversität von rhizosphären PGPB
entwickelt und verbessert um Verbindungen zwischen applizierten PGPB und deren Aktivitäten zu
prüfen. Die sensitive quantitative real-time PCR Methode wurde zur Quantifizierung bzw. zum
Nachweis der inokulierten PGPB und zum Nachweis des nitrogenase-reduktase Gens (nifH), des
Markergens für potentiell diazotrophe Bakterien, genutzt.
Bakterienart spezifische Primer wurden aus dem Sequenzvergleich der 16S-23S ISR ausgewählter
Bakterienstämme selektiert und Protokolle zur Quantifizierung dieser Bakterienarten erarbeitet. Die
Protokolle basierten auf der real-time PCR Methode und dem Einsatz der selektierten artspezifischen
Primer. Ziel der Untersuchungen war die Besiedlungsfähigkeit inokulierter Bakterien an
Pflanzenwurzeln zu analysieren. Die Anwendung der früher selektierten universellen nifH Primer in der
quantitativen real-time PCR verbesserte die Nachweisgrenze von diazotrophen Bakterien signifikant.
Somit konnten diazotrophe Bakterien, die nur in geringer Zellzahl an Pflanzenwurzeln in trockenen
Regionen vorkommen, entdeckt und quantifiziert werden. Die Protokolle wurden unter Einsatz von
diazotrophen Referenzstämmen getestet und optimiert und nachfolgend zur Messung an zwei
Gemüsearten angewendet. Die Ergebnisse der real-time PCR Messungen, die an DNA Extrakten aus
Pflanzenwurzeln von Gurke und Tomate durchgeführt wurden, zeigten, dass das vorliegende nifH PCR
Protokoll zur Differenzierung der Bakterienpopulationen diazotropher Bakterien zwischen
verschiedenen Pflanzenarten geeignet ist.
Die neu entwickelten Methoden wurden zum Studium des nifH Vorkommens und der Prüfung der
Besiedlungsfähigkeit von Bacillus licheniformis und Xanthomonas sp. an Tomaten Wurzeln eingesetzt,
die in nicht sterilisiertem Quarz Sand wuchsen. Unter Stickstoff limitierten Bedingungen waren sowohl
die Anzahl diazotropher Bakterien als auch der nifH Genpool erhöht, während bei hoher N-Versorgung
der Pflanzen die Anzahl diazotropher Bakterien sowohl in inokulierten als auch nicht inokulierten
Varianten reduziert waren. Außerdem bestand eine enge signifikante Korrelation zwischen nifH Gen
Vorkommen und N-Aufnahme der Pflanzen und die Dichte der inokulierten Bakterien zeigte einen
direkten Beitrag der applizierten Bakterien zur N-Ernährung der Pflanzen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass das Monitoring des nifH Gen Vorkommens in
Pflanzenwurzeln eine vielversprechende Methode ist, um die potentielle Luftstickstoffbindungsaktivität
inokulierter diazotropher Bakterien zu analysieren. Die nifH Gen Quantifizierung an Pflanzen eröffnet
die Möglichkeit Schlüsselorganismen in