The cuprizone model and multiple sclerosis [Elektronische Ressource] : disparities and similarities / Markus Kipp

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“The cuprizone model and multiple sclerosis: disparities and similarities“ Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der RWTH Aachen University zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation vorgelegt von Priv. Doz. Dr. med. Markus Kipp aus Oberndorf am Neckar Berichter: Universitätsprofessor Dipl. Ing. Dr. Werner Baumgartner Universitätsprofessor Dr. hum. biol. Cordian Beyer Tag der mündlichen Prüfung: 22. August 2011 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar. 2 SUMMARY 5 (ENGLISH) 5 (GERMAN) 6 GENERAL INTRODUCTION 9 1. MULTIPLE SCLEROSIS 9 1.1 GENERAL REMARKS 9 1.2 CLINICAL ASPECTS OF THE DISEASE 9 1.3 AETIOLOGY 9 1.4 THERAPEUTIC OPTIONS 10 1.5 RELEVANT ANIMALS MODELS IN MS RESEARCH 10 1.6 NEUROPATHOLOGY 11 1.7 GREY MATTER PATHOLOGY IN MULTIPLE SCLEROSIS 13 2. THE TOXIC CUPRIZONE DEMYELINATION MODEL 14 3. REMYELINATION IN MULTIPLE SCLEROSIS 15 4. AIMS AND SCOPE OF THE STUDY 16 MATERIALS AND METHODS 17 1. ANIMALS AND DISEASE INDUCTION 17 2. TISSUE PREPARATION 17 3. MULTIPLE SCLEROSIS MATERIAL 17 4. IMMUNOHISTOCHEMISTRY 18 5. HISTOCHEMISTRY 18 6. ELECTRON-MICROSCOPY AND SEMI-THIN SECTIONS 19 7. IMMUNOFLOURESCENCE DOUBLE LABELLING 19 8.

Sujets

• Gesundheit

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• Publié le: 01 janvier 2011
• Nombre de lectures: 213
• Langue: English
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Extrait

 

“The cuprizone model and multiple sclerosis:

disparities and similarities“

 

 

 

 

Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften

der RWTH Aachen University zur Erlangung des akademischen Grades eines

          Berichter:

   

Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation

 

 

vorgelegt von

Priv. Doz. Dr. med. Markus Kipp

aus Oberndorf am Neckar

Universitätsprofessor Dipl. Ing. Dr. Werner Baumgartner

Universitätsprofessor Dr. hum. biol. Cordian Beyer

22. August 2011

        Tag der mündlichen Prüfung:        Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.        

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                                              

2

 

 

SUMMARY

(E NGLISH ) (G ERMAN )

GENERAL INTRODUCTION

 

1.   M ULTIPLE SCLEROSIS   1.1   G ENERAL REMARKS   1.2   C LINICAL ASPECTS OF THE DISEASE   1.3   A ETIOLOGY   1.4   T HERAPEUTIC OPTIONS   1.5   R ELEVANT ANIMALS MODELS IN MS RESEARCH   1.6   N EUROPATHOLOGY   1.7   G REY MATTER PATHOLOGY IN MULTIPLE SCLEROSIS   2.   T HE TOXIC CUPRIZONE DEMYELINATION MODEL   3.   R EMYELINATION IN MULTIPLE SCLEROSIS   4.   A IMS AND SCOPE OF THE STUDY  

MATERIALS AND METHODS

1.   A NIMALS AND DISEASE INDUCTION   2.   T ISSUE PREPARATION   3.   M ULTIPLE SCLEROSIS MATERIAL   4.   I RYHEOCSTMIUMONIHTSM   5.   H SIMEYRTSIHCOT   6.   E LECTRON - MICROSCOPY AND SEMI - THIN SECTIONS   7.   I MMUNOFLOURESCENCE DOUBLE LABELLING   8.   S DEMYELINATION AND QUANTIFICATION OF CELL NUMBERCORING OF   9.   G ENE EXPRESSION ANALYSIS   10.   A FFYMETRIX G ENE C HIP ® 11.   T RANSFECTION EXPERIMENTS   12.   W ESTERN B LOT ANALYSIS   13.   S TATISTICAL ANALYSIS  

RESULTS

5  

5   6  

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9   9   9   9   10   10   11   13   14   15   16  

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24  

C HAPTER 1:   T HE HIPPOCAMPUS AND BASAL - GANGLIA COMPLEX ARE AFFECTED IN THE CUPRIZONE MODEL AND MULTIPLE SCLEROSIS  24   1.1   C UPRIZONE - TREATMENT INDUCES DEMYELINATION OF THE HIPPOCAMPUS  24   1.2   I MOST PRONOUNCED IN DEMYELINATED HIPPOCAMPAL WHITE MATTERNFLAMMATION IS STRUCTURES  26   1.3   C OMPARISON OF HIPPOCAMPAL LESIONS IN THE CUPRIZONE MODEL AND MULTIPLE SCLEROSIS  27   1.4   B ASALGANGLIA DEMYELINATION AND INFLAMMATION  28   C HAPTER 2:   R EGION - SPECIFIC LOCAL BRAIN RESPONSES ACCOUNT FOR REGIONAL DIFFERENCES IN CUPRIZONE - INDUCED DEMYELINATION  30   2.1   T HE HIPPOCAMPAL FIMBRIA REGION IS RESISTANT TO CUPRIZONE INTOXICATION DESPITE MICROGLIOSIS  30   2.2   R INFLAMMATION DETERMINES DEMYELINATION IN THE CUPRIZONE MODELEGION SPECIFIC  30   C HAPTER 3:   I NFLAMMATORY RESPONSE DEPENDS ON EXTEND OF MYELIN LOSS IN EXPERIMENTAL DEMYELINATION AND MULTIPLE SCLEROSIS T YPE 1 LESIONS  33   3.1   C GREY MATTER DEMYELINATION IS PROMINENT IN THE CUPRIZONE MODELORTICAL  33  

 3                                                                              

 

3.2   M AGNITUDE OF MYELIN LOSS WITHIN THE CORTICAL GREY MATTER OF CUPRIZONE - TREATED MICE  33   3.3   D EMYELINATION IS PARALLELED BY OLIGODENDROCYTE LOSS  35   3.4   M AND ASTROCYTE RESPONSE ARE MAINLY DETERMINED BY MYELIN DEBRISICROGLIA  35   3.5   M AGNITUDE OF MICROGLIA ACTIVATION IN T YPE 1 MULTIPLE SCLEROSIS LESIONS DEPENDS ON LESION ACTIVITY  38   C HAPTER 4:   B BINDING PROTEIN EXPRESSION IN ACTIVATED ASTROCYTESRAIN LIPID : POTENTIAL TARGET FOR REMYELINATION THERAPY  42   4.1   R PROLONGED CUPRIZONE EXPOSURE DESPITE THE PRESENCE OFEMYELINATION IS LIMITED AFTER OLIGODENDROCYTE PROGENITOR CELLS  43   4.2   R EMYELINATION APPEARS TO BE LIMITED DUE TO THE ABSENCE OF PRO - MYELINATION FACTORS  43   4.3   I NFLAMMATORY RESPONSE IS CRITICAL FOR ENDOGENOUS REMYELINATION  45   4.4   V ALIDATION OF A FFYMETRIX G ENE C HIP ® ANALYSIS  48   4.5   I NFLAMMATORY CELL COMPOSITION DIFFERS BETWEEN ACUTE AND CHRONIC LESIONS  49   4.6   GFAP + ASTROCYTES STRONGLY EXPRESS THE RADIAL GLIA CELL MARKER BLBP IN ACUTELY BUT NOT CHRONICALLY DEMYELINATED LESIONS  51   4.7   E XPRESSION OF BLBP IN ACTIVATED GFAP +   ASTROCYTES STRONGLY CORRELATES WITH THE PRESENCE OF O LIG 2TRSGON + OLIGODENDROCYTE PROGENITOR CELLS IN THE CUPRIZONE MODEL  53   4.9   N UMBER OF BLBP- EXPRESSING ASTROCYTES IN HUMAN MS LESIONS DECLINES WITH DISEASE DURATION  56   4.10   E XPRESSION OF BLBP IN U87 ASTROCYTOMA CELLS REGULATES FGF2,   PDGF-AA AND SPP1   BUT NOT IGF1 M RNA EXPRESSION  59  

DISCUSSION 

1.   T HE CUPRIZONE MODEL AS A TOOL TO STUDY DEMYELINATION   2.   M ECHANISM OF CUPRIZONE - INDUCED DEMYELINATION   3.    W HAT DETERMINES MICROGLIA ACTIVATION ? 4.   T HE CUPRIZONE MODEL AS A TOOL TO STUDY REMYELINATION   5.   I DENTIFICATION OF ONGOING REMYELINATION   6.   R ELEVANCE OF INFLAMMATION FOR REMYELINATION   7.   A STROGLIA : GENERAL REMARKS   8.   BLBP EXPRESSION IN ASTROCYTES   9.   P OSSIBLE ROLE OF BLBP FOR ASTROCYTE - MEDIATED OLIGODENDROCYTE MATURATION  

REFERENCES 

LIST OF PUBLICATIONS

R ESEARCH ARTICLES   R EVIEW ARTICLES  

CURRICULUM VITAE (DEUTSCH)

APPENDIX

A PPENDIX 1:   T RANSCARDIAL PERFUSION OF MICE   A PPENDIX 2:   P ARAFFIN - EMBEDDING OF MICE TISSUE SAMPLES   A PPENDIX 3:   I MMUNOHISTOCHEMISTRY   A PPENDIX TABLE 1:   C LINICAL DETAILS OF PATIENTS ( CHAPTER 3) A PPENDIX TABLE 2:   C LINICAL DETAILS OF PATIENTS ( CHAPTER 4) A PPENDIX TABLE 3:   L IST OF ANTIBODIES   A PPENDIX TABLE 4:   L IST OF PRIMERS  

 4  

60  

60   62   62   64   65   66   67   68   69  

70  

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75   77  

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79   79   80   81   82   83   84  

Summary

(English)  

 

Multiple sclerosis (MS) is a chronic, inflammatory and demyelinating disorder of the central nervous

system. Although demyelination is still a characteristic entity, it has become increasingly apparent in

recent years that substantial axonal destruction and neuronal loss are equally important features. The

frequent involvement of grey matter structures has received new impetus. Studies on the pathogenesis

of grey matter lesions suggest that its underlying disease mechanisms are unique. Less marked

microglia activation in grey compared to white matter lesions is obvious but underlying mechanisms

are poorly understood. Adequate animal models are a likewise powerful and irreplaceable tool to study

disease pathogenesis. In order to serve as a useful model, it should be similar in its aetiology or

phenotype. The recognition of the importance of grey matter pathology in MS did lead to the desire for

animal models that display grey matter damage. Within the scope of the presented thesis, I

characterized the toxic cuprizone model with a special focus on grey matter pathology. This work is

not confined to descriptive changes but makes a comparison between the model itself and MS. In

recent years the contribution of innate immune cells in mediating MS pathogenesis is being

appreciated. We were able to show that histopathological hallmarks of MS are closely mirrored by the

cuprizone model. Furthermore, our studies clearly demonstrate that the magnitude of microglia

activation is related to the amount of myelin debris during a demyelination event. Thus, the lower

inflammatory infiltrate of grey matter lesion is not related to a unique grey matter cytoarchitecture that

makes it more resistant to inflammation. Differences in myelination account for observed regional

differences.

The second part of this thesis deals with one of the most effective repair mechanisms in the central

nervous system, i.e. remyelination. A better understanding of the remyelination processes in MS and

possible reasons for its failure is required. We created lesions with either robust or impaired

endogenous remyelination capacity. Lesions were analyzed for mRNA expression levels by gene-chip

arrays. One finding was the predominance of immune and stress response factors in the group of genes

which were classified as remyelination-supporting factors. We further demonstrate that lesions with

impaired remyelination capacity show weak expression of the radial-glia cell marker brain lipid

binding protein (BLBP) whereas expression of this marker protein is high in lesions with marked

remyelination. The expression of BLBP in activated astrocytes correlates with the presence of

oligodendrocyte progenitor cells. Highest numbers of BLBP-expressing astrocytes were evident in

lesions of early MS whereas significantly less are present in tissue samples from patients with long

disease duration. Transfection experiments show that BLBP regulates growth factor expression in U87

astrocytoma cells. In conclusion, we provide evidence that expression of BLBP in activated astrocytes

orchestrates remyelination.

                                                                              

5

(German)  

 

Die Multiple Sklerose (MS) ist eine chronisch entzündliche Entmarkungserkrankung des Zentralen

Nervensystems. Obwohl der Verlust der Myelinscheide auch heute noch ein zentraler Bestandteil der

pathologischen Diagnosestellung darstellt zeigen sich auch Schäden im Bereich der grauen Substanz,

die Nervenzellkörper enthält. Das Fortschreiten der Behinderung der Patienten hängt wesentlich von

der Schädigung dieser grauen Substanz ab. Es wird vermutet, dass sich die zu Grunde liegenden

Mechanismen der Gewebedestruktion in weißer und grauer Substanz unterscheiden. Die

Entzündungsherde in der grauen Substanz sind meist weniger stark ausgeprägt.

Tiermodelle sind unersetzbare Werkzeuge zum erforschen neuer therapeutischer Ansätze. Vor allem

der „graue“ Aspekt der MS wurde bisher in Tiermodellen nur unzureichend untersucht. Im Rahmen

der vorgelegten Arbeit charakterisierten wir das sog. „Cuprizone“ MS Modell. Sowohl die Beteiligung

der grauen Substanz als auch regionale Unterschiede der Mikroglia-Aktivierung standen im

Mittelpunkt meiner Untersuchungen. Des Weiteren wurden vergleichende Studien zur humanen

Pathologie durchgeführt. Wir können zeigen, dass wesentliche Aspekte bei MS durch das Cuprizone

Tiermodell repräsentiert werden. Die gängige Vermutung, dass geringer ausgeprägte

Entzündungsherde der grauen Substanz auf zytoarchitektonische Besonderheiten zurück zu führen

sind konnten teilweise widerlegt werden. Die Menge an anfallenden Myelin Abbauprodukten im

Rahmen einer akuten Demyelinisierung scheinen vielmehr eine wichtige Rolle zu spielen.

Zugrundeliegende Mechanismen des Wiederaufbaus von Markscheiden nach Demyelinisierung ist ein

weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit. Axonale Protektion ist eine der großen Herausforderungen bei der

Behandlung demyelinisierender Erkrankungen, allen voran bei chronischen Verlausformen der MS.

Remyelinisierung spielt in diesem Zusammenhang eine entscheidende Rolle. Es handelt sich hierbei

um einen höchst effektiven Reparaturmechanismus des Zentralen Nervensystems der aus noch nicht

geklärter Ursache bei MS Patienten im Krankheitsverlauf zum Erliegen kommt. In unseren Studien

benutzten wird das toxische Cuprizone Demyelinisierungsmodell. Ein entscheidender Vorteil dieses

Modells besteht in der Möglichkeit Läsionen mit und ohne endogener Remyelinisierungskapazität

generieren zu können. Mit Hilfe der Affymetrix Array Technologie konnten wir etliche Faktoren

identifizieren, die im Rahmen des Aufbaus entmarkter Axone von Bedeutung sind. Unsere Ergebnisse

deuten darauf hin, dass ruhende Astrozyten im Rahmen der Demyelinisierung zu radialen-Glia

ähnlichen Zellen de-differenzieren, um dann im Prozess der Remyelinisierung eine entscheidende

Rolle zu spielen. Die Expression von Fettsäure-bindenden Proteinen wie BLBP scheint wichtig.

Sowohl im Tiermodell als auch bei MS korreliert das BLBP Expressionsniveau positiv mit der

Remyelinisierungspotenz. Durch stabile Transfektion konnten wir ausserdem aufzeigen, dass BLBP

direkt an der Expression verschiedener Wachstumsfaktoren von Astrozyten beteiligt ist. Dieser Teil

der vorgelegten Arbeit leistet einen wesentlichen Beitrag zu einem besseren Verständnis der Rolle von

Astrozyten bei Remyelinisierung.

 6

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

arachidonic acid

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

central nervous system

2',3'-cyclic nucleotide 3' phosphodiesterase

fatty acid binding protein

experimental autoimmune encephalomyelitis

docosahexaenoic acid

Epstein-Barr-Virus 

fetal calf serum

fibroblast growth factor 2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

corpus callosum

brain lipid binding protein

bicinchoninic acid

blood-brain barrier

aquaporin-4

Alexander disease

 

 

PP-MS

MS

pMcx

PPAR

PDGFα  

PLP

MRI(s)

OPC

MOBP

MOG

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

NAWM

NMO

NAGM

primary progressive multiple sclerosis

peroxisome proliferator-activated receptor

primary somato-motor cortex

proteolipid protein (myelin) 1

 

 

 

figure(s)

 

 

 

 

 

 

 

 

Luxol Fast Blue and Periodic Acid Schiff

immunohistochemistry 

myelin-associated oligodendrocyte basic protein

myelin-associated glycoprotein

hematoxylin and eosin

glial fibrillary acidic protein

hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1

human leukocyte antigen

normal-appearing grey matter

normal-appearing white matter

myelin oligodendrocyte glycoprotein

magnetic resonance imaging(s)

multiple sclerosis

platelet-derived growth factor alpha polypeptide

oligodendrocyte progenitor cell

neuromyelitis optica

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                                                

 

 

 

 

 

 

 

BCA

BLBP

CC

CNPase

CNS

DHA

EAE

EBV

 

Abbreviations    

 

AA

 

AD

AQP4

BBB

H&E

 

 

HLA

IHC

HPRT

MAG

LFB/PAS

FCS

FABP

Fig(s)

FGF2

 

GFAP

 

 

8

                                                                              

 

  

SEM

SP-M

S

ec

 

 

s

 

wks

 

 

SPP1

 

TNFα 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

PUFA

pScx

 

PPWM

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

rtPCR

 

 

 

 

 

 

relapsing-remitting multiple sclerosis

region of interest

cti

on

primary somato-sensory c

or

polyunsaturated fatty a

cid

x

pe

t

e

er

 

ri-plaque whit

e matt

 

ROI

RR-M

S 

 

 

 

weeks

 

umor ne

crosis fa

ctor-

α 

t

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

osteopontin

 

sive multi

secondary progres

clerosis

ple s

or of the mea

standard err

seconds

n

Reverse-transcription polymerase chain r

 

a

e