The halobacterium salinarum taxis signal transduction network [Elektronische Ressource] : a protein-protein interaction study / Matthias Schlesner

Matthias Schlesner

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• Biologie

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• Publié par: ludwig-maximilians-universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 46
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 9 Mo

Extrait

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Ludwig-Maximilians-Universität München
The Halobacterium salinarum
Taxis Signal Transduction Network:
a Protein-Protein Interaction Study
Matthias Schlesner
aus Kiel
2008Erklärung
DieseDissertationwurdeimSinnevon§13Abs.3bzw.4derPromotionsordnungvom
29. Januar 1998 von Herrn Prof. Dr. Dieter Oesterhelt betreut.
Ehrenwörtliche Versicherung
Diese Dissertation wurde selbständig und ohne unerlaubte Hilfe angefertigt.
Martinsried, am 07.10.2008
Matthias Schlesner
Dissertation eingereicht am: 14.10.2008
1. Gutachter: Prof. Dr. Dieter Oesterhelt
2. Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Marwan
Mündliche Prüfung am: 9.12.2008Meiner FamilieContents
Summary xvii
1 Background 1
1.1 H.salinarum, an archaeal model organism . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1.1 Halobacterium salinarum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1.2 Archaea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.3 Halophiles and their ecology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1.4 Adaptation to hypersaline environments . . . . . . . . . . . . . 4
1.1.5 Bioenergetics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2 Signal transduction and taxis in prokaryotes . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2.1 Two-component systems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2.2 The principles of prokaryotic taxis . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3 Protein-protein interaction analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.4 Objectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2 Materials and methods 15
2.1 General materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.1 Instruments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.2 Chemicals and Kits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.3 Enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.4 Strains . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.1.5 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.2 General methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.2.1 Growth and storage of E.coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.2.2 Growth and storage of H.salinarum . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.2.3 Separation of DNA fragments by agarose gel electrophoresis . . 18
2.2.4 Purification of DNA fragments. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.2.5 Analytical and preparative restriction digestion . . . . . . . . . 18
2.2.6 Dephosphorylation of linearised plasmids . . . . . . . . . . . . . 19
2.2.7 Ligation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.2.8 In-Fusion™ cloning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.2.9 Gateway™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.2.10 Transformation of E.coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.2.11 Transformation of H.salinarum . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.2.12 Polymerase chain reaction (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
viiContents
2.2.13 DNA sequencing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.2.14 Isolation of plasmid DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.2.15 Protein precipitation with TCA . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.2.16 SDS PAGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.2.17 Coomassie staining of protein gels . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.2.18 Silver staining of protein gels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.2.19 Western blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.2.20 Preparation of genomic DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.3 Materials and methods for yeast two-hybrid screening . . . . . . . . . . 28
2.3.1 Growth and storage of S.cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.3.2 Construction of two-hybrid expression plasmids . . . . . . . . . 28
2.3.3 Transformation of yeast . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.3.4 Protein interaction assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.4 Materials and methods for AP-MS of halobacterial protein complexes . 32
2.4.1 Construction of vectors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.4.2 Generation of bait expression and control strains . . . . . . . . 34
2.4.3 Establishing the affinity purification procedure . . . . . . . . . . 35
2.4.3.1 Purification from E.coli . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.4.3.2tion from H.salinarum . . . . . . . . . . . . . 36
2.4.4 Affinity purification of CBD-tagged proteins . . . . . . . . . . . 37
2.4.5 CBD-AP and SILAC: Direct bait fishing . . . . . . . . . . . . . 38
2.4.6 CBD-AP and SILAC: Indirect bait fishing . . . . . . . . . . . . 38
2.4.7 Mass spectrometry: Sample preparation . . . . . . . . . . . . . 39
2.4.8 Mass spect: Data acquisition . . . . . . . . . . . . . . . 41
2.4.9 Mass spectrometry: Data processing . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.4.10 Determination of SILAC ratios . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.4.11 Thresholds and statistics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.5 Materials and methods for the chemotaxis protein interaction network . 44
2.5.1 Generation of expression and control strains . . . . . . . . . . . 44
2.5.2 Bait fishing, mass spectrometry, data analysis . . . . . . . . . . 44
2.5.3 Che protein interactions in other organisms . . . . . . . . . . . 45
2.6 Materials and methods for identification of archaea-specific Che proteins 48
2.6.1 Construction of in frame deletion mutations . . . . . . . . . . . 48
2.6.2 Southern blot analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.6.3 Complementation of deletions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.6.4 Swarm plates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.6.5 Computerised cell tracking (Motion analysis) . . . . . . . . . . . 50
2.6.6 Dark-field microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.6.7 Bioinformatic analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
viiiContents
3 Yeast two-hybrid analysis of halobacterial proteins 57
3.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
3.2 Results and Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
3.2.1 Analysis of a test set of proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
3.2.2 Rescreening with higher stringency . . . . . . . . . . . . . . . . 59
3.2.3 Halobacterial proteins and yeast transcriptional activation . . . 60
3.3 Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
4 Affinity purification and mass spectrometry of halobacterial protein com-
plexes 63
4.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
4.2 Results and Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
4.2.1 Construction of vectors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
4.2.2 The purification procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
4.2.2.1 Expression in E.coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
4.2.2.2 Expression in H.salinarum . . . . . . . . . . . . . . . 70
4.2.3 Identification by mass spectrometry . . . . . . . . . . . . . . . . 72
4.2.3.1 Identification by MALDI TOF PMF . . . . . . . . . . 72
4.2.3.2 Identification by LC MS/MS . . . . . . . . . . . . . . 74
4.2.4 SILAC: Discrimination of interaction partners from background 75
4.2.4.1 Direct bait fishing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.2.4.2 The exchange problem . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
4.2.4.3 Indirect bait fishing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
4.2.4.4 Thresholds . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
4.3 Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
5 The bioinformatics environment 83
5.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
5.2 The databases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
5.2.1 Bait DB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
5.2.2 Experiment DB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
5.2.3 Result DB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
5.3 The applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
5.3.1 Bait management . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
5.3.2 Experiment management . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
5.3.3 Result evaluation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
5.4 Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
6 Chemotaxis protein interaction network 91
6.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
6.1.1 The Che system: a specialised two-component system for taxis
signalling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
ixContents
6.1.1.1 Signal reception and transduction . . . . . . . . . . . . 91
6.1.1.2 Excitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
6.1.1.3 Adaptation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
6.1.1.4 Signal termination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
6.1.1.5 Fumarate as switch factor . . . . . .