The non-apoptotic function of Caspase-8 in enothelial precursor cells [Elektronische Ressource] / Dörte Scharner

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• Publié par: goethe_universitat_frankfurt_am_main
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 34
• Langue: Deutsch
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Extrait

The non-apoptotic function of Caspase-8 in
endothelial precursor cells

Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften

vorgelegt beim Fachbereich Biowissenschaften
der Johann Wolfgang Goethe-Universität
in Frankfurt am Main


Dörte Scharner
born in Stralsund/ Mecklenburg-Vorpommern


Frankfurt, 2009

Die nicht-apoptotische Funktion
von Caspase-8 in endothelialen
Vorläuferzellen

Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften

vorgelegt beim Fachbereich Biowissenschaften
der Johann Wolfgang Goethe-Universität
in Frankfurt am Main

von
Dörte Scharner
geboren in Stralsund/ Mecklenburg-Vorpommern


Frankfurt 2009




Vom Fachbereich Biowissenschaften der Goethe Universität als
Dissertation angenommen


Dekan: Herr Professor Dr. Volker Müller


1.Gutachter: Frau Professorin Dr. Anna Starzinski-Powitz
2.Gutachter: Frau Professorin Dr. Stefanie Dimmeler




Datum der Disputation: 20.Juli 2009Danksagung
An dieser Stelle möchte ich denjenigen danken, die mir mein Studium und die
Promotion ermöglichten und jederzeit unterstützend beiseite standen.
Für die Bereitstellung des interessanten Themas und den hervorragenden
Arbeitsbedingungen möchte ich Frau Prof. Dr. Stefanie Dimmeler und Herrn Prof. Dr.
Andreas Zeiher danken. Weiterhin möchte ich PD Dr. med. Lothar Rössig für die
zahlreichen wissenschaftlichen Diskussionen und die Unterstützung zum Gelingen
dieser Arbeit danken.
Weiterhin gilt großer Dank meinen Kollegen und gleichzeitig Freunden Dr. Angelika
Bonauer, Ariane Fischer, Dr. Guillaume Carmona, Dr. Alessia Orlandi und Carmen
Döbele für die wissenschaftliche Diskussionen während der Entstehung der Arbeit
als auch die Teilhabe in anderen Lebenslagen innerhalb und ausserhalb dieser
Arbeitszeit.
Ich danke dem gesamten Team der molekularen Kardiologie bestehend aus
technischen Assistenten, Doktoranden und Post-Docs für die schöne 3-jährige
Laborzeit, die auch ab und an andererorts ausgeklungen ist, was wiederum die gute
Teamfähigkeit und den Zusammenhalt der Arbeitsgruppe zeigt.
Hierbei möchte ich mich weiterhin besonders bei dem „tierischen“ Team Ariane
Fischer, Marion Muhly-Reinholz und Tino Röxe für ihre Geduld und Aufopferung
bedanken.
Desweiteren danke ich Dorit Lüthje, Tina Rasper und Carmen Schön für ein
angenehm entspanntes, freundschaftliches und motivierendes Laborklima, wo auch
immer ein paar Scherze den Laboralltag erheiterten. Nicht zuletzt sollen Andrea
Knau, Nicole Konecny und Natalja Reinfeld erwähnt werden für ihre zu jeder Zeit
hilfsbereite Art in bester Laune.
Meiner Familie danke ich für die ständige finanzielle und seelische Unterstützung
während meiner gesamten Ausbildungszeit, gefolgt von Aufmunterungen, viel Liebe
und der Glauben an mich auch in seelisch schweren Zeiten.
Meinem Schatz Torben danke ich für seine Geduld und die vielen Aufmunterungen in
der wenigen Zeit, die wir an den Wochenenden während dieser Arbeit miteinander
hatten.

Contents
1. Introduction............................................................................................... 1
1.1 Vasculogenesis, Angiogenesis and Arteriogenesis .................................... 1
1.1.1 Vasculogenesis ....................................................................................... 1
1.1.2 Angiogenesis........................................................................................... 2
1.1.3 Arteriogenesis ......................................................................................... 4
1.2 Structure and maturation of blood vessels.................................................. 4
1.3 Endothelial precursor (progenitor) cells ...................................................... 5
1.4 Endothelial precursor (progenitor) cells for therapeutic use........................ 7
1.5 EPC function in diseases............................................................................ 8
1.6 Caspases and their function ....................................................................... 8
1.7 Non-apoptotic functions of caspases ........................................................ 11
1.8 Caspase-8 ................................................................................................ 12
1.9 Integrins and their function in vasculogenesis and angiogenesis ............. 13
1.10 Cbl-b, an E3 ubiquitin ligase ..................................................................... 15
1.11 Aim of this study ......................................................................................... 1
2. Materials and Methods ............................................................................. 2
2.1 Cells............................................................................................................ 2
2.2 Cell culture of HUVEC, HMVEC and HEK293T .......................................... 2
2.3 Isolation and ex vivo endothelial differentiation of human endothelial
progenitor cells (EPC)................................................................................. 4
2.4 Isolation of EPCs from mouse spleen - EPC-assay.................................... 4
2.5 Gene knockdown by RNA interference (siRNA-mediated).......................... 5
2.6 RNA isolation .............................................................................................. 6
2.7 Oligonucleotide microarrays (Affymetrix, Inc.) ............................................ 6
i

2.8 RT-PCR ...................................................................................................... 7
2.9 Plasmid transfection in HUVEC and HEK293 using Superfect (Qiagen) .... 8
2.10 Lentivirus-transduction in HUVEC and EPC ............................................... 9
2.11 Protein isolation from whole cells................................................................ 9
2.12 Immunoprecipitation.................................................................................. 10
2.13 Colorimetric analyses of protein concentration according to Bradford ...... 10
2.14 SDS-polyacrylamid gel electrophoresis (SDS-PAGE)............................... 10
2.15 Wet-blot method for specific protein detection (Western blot)................... 11
2.16 Adhesion assays....................................................................................... 12
2.17 EPC and HUVEC migration assay............................................................ 13
2.18 “Scratch wound” assay ............................................................................. 13
2.19 Spheroid assay ......................................................................................... 14
2.20 Detection of proteins in whole cells by fluorescence microscopy.............. 15
2.21 Fluorescence activated cell sorting (FACS) of EPCs and mice bone marrow
cells........................................................................................................... 15
2.22 Apoptotic measurement of endothelial precursor cells with Annexin V (BD
Pharmingen) ............................................................................................. 16
2.23 Caspase activity analysis.......................................................................... 17
2.24 Murine ischemic hind limb model and BMC transplantation...................... 17
2.25 Immunohistochemistry.............................................................................. 18
2.26 Matrigel plug assay................................................................................... 18
2.27 Statistical analysis..................................................................................... 19
3. Results..................................................................................................... 20
3.1 Caspases in endothelial precursor cells.................................................... 20
3.2 Caspase-8 expression in human cells ...................................................... 22
ii

3.3 Caspase-8 activity is required for pro-angiogenic cell function ex vivo ..... 23
3.4 Caspase-8 inhibition plays a role in cytokine release ............................... 26
3.5 The activity of caspase-3 is not increased in adherent EPC..................... 27
3.6 In vivo incorporation and improvement of neovascularization by
transplanted human outgrowing precursor cells is reduced by caspase-8
inhibition.................................................................................................... 30
3.7 Caspase-8 deficiency in vivo reduces functionality and vascularization
capacity of bone marrow mononuclear cells............................................. 32
3.8 Cell surface receptor regulation by caspase-8 inhibition........................... 39
3.9 Caspase-8 targets Cbl-b........................................................................... 43
3.10 Cbl-b influences angiogenesis ............................................................