The role of HAX1 in neutrophil homeostasis [Elektronische Ressource] / Giridharan Appaswamy

Giridharan Appaswamy

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• Publié par: gottfried_wilhelm_leibniz_universitat_hannover
• Publié le: 01 janvier 2011
• Nombre de lectures: 20
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 15 Mo

Extrait

 
e  role  of  HTh AX1  in  neutrophil  
homeostasis  
 
 
 
 
Von   der  Naturwissenschaftlichen  Fakultät    
der  Gottfried  Wilhelm  Leibniz  Universität  Hannover    
zur  Erlangung  des  Grades    
 
 
Doktor  der  Naturwissenschaften    
Dr.rer.nat.    
 
 
genehmigte  Dissertation    
 
Von  
 
 
 
Master  of  Science  Giridharan  Appaswamy  
geboren  am  07.  Oktober  1980  in  Nagercoil,  Indien  
Hannover  
2010    
 
 
 
 
 
Referee  1   :     Prof.  Dr.   Rita  Gera -­‐Schahn  
Institute  for  Cellular  Chemistr  y
Haover  M    
Ca -­‐Neu -­‐.  1Str  
D-­‐30625  Ha  
Germany  
 
Referee  2   :     Prof.  Dr.   Christh  K  
Department  of  Pediatric  eHmatology  and  Oncology  
Haover  M    
Ca -­‐Neu -­‐.  1Str  
D-­‐30625  Ha  
Germany  
 
Referee  3   :     Prof.  Dr.   Has  Joerg  Ja ,  
Departmet  of  Plan  tG  
Gottfried  Wilhelm  L  ity  univers  
Herrenser  r.  2    
30419  Ha  
Germany  
 
 
 
 
 
thTag  der  promotion  :   19  Octo  2rbe 010  
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Dedicated  to  my  hero,  my   DAD .  
 
 
 
 
 
 
 
 Erklärung  zur  Dissertatio:n  Hierdurch  erkläre  ich,  dass  iichn  eme  Dissertation  mit  
dem  Tite  “lThe  role  of  HAX1  in  neutrophil  homeselostbastsindig  s“   verfasst  und  die  
benutzten   Hilfsmittel   und   Quellen   sowie   gegebenenfalls   die   zu   Hilfeleistungen  
herangezogenen  Institutionen  vol g  angegeben  habe.lstndi  
 
Die  Dissertation  wurde  nicht  schon  als  Masterarbeit,  Diplomarbeit  oder  andere  
Prüfungsarbeit    verwendet  
 
 
 
Giridharan  Appaswamy  
 
 
2  
 
ä
äContents  
1.  Itroducn tion  ................................................................  8  
1.1  Clinical  disea  se...  8  
1.1.1  Neutropeni  a....................................................  8  
1.2  APOPTOSIS  ........  11  
1.2.1  Mitochondria  in  apopt  ................................osis.....................  13  
1.2.2  B-­‐c2  l proteins  ..............................................  15  
1.2.3  Caspases  .........................  16  
1.2.4  Inhibitor  of  apoptosis  prote  ................................ins ............................................  17  
1.2.5  Endoplasmic  reticulum  in  apop  tosis.................................  17  
1.2.6  CHOP  ................................................................................................................................  19  
1.2.7  Bi  P.....  19  
1.3  Autophagy  .........................................  20  
1.3.1  Autophagy  related  g  enes........................  22  
1.4  HAX1  ...................................................  24  
2.  Focus  of  the  current  stud  ................................y....................................  25  
3.  Materials  .....  26  
3.1  Antibodi  es.........................  27  
3.2  Cytokine  s...........................................................  27  
3.3  Cell  culture  re  agents.....  27  
3.4  Chemical  s..........................................................  27  
3.5  Enzymes,  DNA  and  protein  la  ................................dder .........................................................................  28  
3.5  Laboratory  equipment  s..............................  29  
3.7  Kit  ................................s .......................................  29  
3.8  Preparation  of  buffers  meanddia  ...........................................................................................................  29  
4.  Methods  .......................................  30  
4.1  Sequence  analysis  of   HAX1  ..........  30  
4.2  Cells  and  cell  culture  ......................................................  31  
4.2.1  Isolation  of  neutrophil  and    PBMCs.....  31  
4.2.2  Isolation  of  CD34+  cells  from  the  bone    marrow..........  31  
4.2.3  Culturing  of  BM  derived  CD34+    cells  32  
4.2.4  In  vitro  differeatntioni  of  BM  derived  CD34+  cells  to  ne  utrophils .......  32  
4.2.5  Culturing  of  fibroblasts  and  HEK293T    cells...................  33  
4.3  Apoptosis  assay  ...............................................................  33  
4.4  Mitochondria  membrane  potential  assay  ..............................................  33  
4.5  Assay  of  mitochondrial  mass  ......................................  34  
4.6  Cytosolic  ROS  assay  ........................  34  
4.7  Protein  isolation  and  western  blot  analysis  ..........  35  
4.8  Flow  cytometry  analysis  ...............  35  
4.9  Immunofluorescence  and  light  microscopy    36  
4.10  RNA  isolation,  cDNA  synthesis  and  Real  Time  PCR  ..........................  36  
4.11  Molecular  cloning  .........................................................  37  
4.11.1  Geneatairon  oHAf  X1  expression  construc  ................................ts...............  37  
4.11.2  Geneatarion  of  shRNA  constructs  targetiHAnX1g.  ...................................  39  
4.12  Retroviral  gene  transfer  ............................................  40  
4.13  Electron  microscopy  ...................................................  41  
5.  Result  ................................s.........  42  
3  
 5.1  Identification  of  mutatHAionsX1    gein  nomic  DNA  .........................................................................  42  
5.2  Bone  marrow  of  HAX1  mutated  patients  show  a  phenotype  of    SCN. ......  43  
5.3  Mutations  identifHAieX1d    rein  sults  in  complete  absence  of  th  ...........................e  protein  44.  
5.4  Intracytoplasmic  localization  of    H................................AX1 .................................................................  46  
5.5  HAX1  deficient sh  ocwe  anll  s  increased  rate  of  apop  tosis ..........................  47  
5.6  HAX1  deficient  cells  show  a  rapiMMPd  los  (sΔΨ  of  )  ..  50  m
5.7  HAX1  deficient  cells  show  increased  caspa