The well-tempered thrombin [Elektronische Ressource] : a systematic crystallographic and calorimetric study on the thermodynamics of serine-protease inhibition / vorgelegt von Bernhard Baum

Bernhard Baum

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• Publié le: 01 janvier 2009
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• Langue: English
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Extrait

The well-tempered Thrombin
A systematic crystallographic and calorimetricy sotnu d
the thermodynamics of serine-protease inhibition





Dissertation
zur Erlangung des
Doktorgrades der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)


Dem Fachbereich Pharmazie
der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von

Bernhard Baum
aus Hameln

Marburg/Lahn 2009
Diedieser Arbeit zugrundeliegenden Untersuchungen w urden auf Anregung von Herrn Prof.
Dr. Gerhard Klebe in der Zeit von September 2005 sb iApril 2009 am Institut für
Pharmazeutische Chemie des Fachbereiches Pharmazie der Philipps-Universität Marburg
durchgeführt.











Vom Fachbereich Pharmazie der Philipps-UniversiMtaärbt urg
als Dissertation angenommen am:
Erstgutachter: Prof. Dr. Gerhard Klebe
Zweitgutachter: Prof. Dr. Torsten Steinmetzer


Tag der mündlichen Prüfung: 28.08.2009
Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht:

Tagungsbeiträge

A library of serine protease inhibitors to syisctaelmlya tstudy thermodynamic and structural
properties of protein-ligand interactions
Applications of BioCalorimetry, Juli 2006, (ZSapraagnoizean), Poster selected for oral presentation

Binding affinity: More than the sum of its parts?
Summer School für Medizinische Chemie, September 206, Regensburg, Poster

Understanding Structure-Activity Relationships: Trhmeodynamic and Crystallographic Studies of
Thrombin Inhibitors
Frontiers in Medicinal Chemistry, Joint German-Sws iMseeting on Medicinal Chemistry, März 2007,
Berlin, Poster

Understanding Structure-Activity Relationships: Trhmeodynamic and Crystallographic Studies of
Thrombin Inhibitors
Biophysics of ligand binding to drug targets,0 0M7a,i I2llkirch (Frankreich), Poster

Thermodynamic and crystallographic characterizati onf protein-ligand interactions
International Workshop “Merging Chemical & Bioloagli cSpace”, März 2007, Marburg, Po ster

Understanding Structure-Activity Relationships: Trhmeodynamic and Crystallographic Studies of
Thrombin Inhibitors,
Applications of BioCalorimetry, Juli 2007,U SBAos)t,o nP (oster

Aufsätze
Gerlach, C., Munzel, M., Baum,, BG.erber, H. D., Craan, T., Diederich, W. Ee., &G. K(l2e0b07).
KNOBLE: a knowledge-based approach for the densdig ns yanthesis of readily accessible small-
molecule chemical probes to test protein binAdnignegw. Chem Int Ed Eng 4l 6, 9105-9.


Baum B. ,Mohamed M., Zayed M., GerlachC, Heine, A., HangauerD,. and Klebe, G. (2009)
More than a simple lipophilic contact: A dethaeilremd odtynamic analysis of nonbasic residues in
the S1-pocket of ThrombiJno.u rnal of Molecular Biology ,390, 56-69.


Baum B. , Muley L., Heine, A., HangauDer., and Klebe, G. (2009)
Think twice: Understanding the high potency pohfe nbyisl -methane inhibitors of thrombJionu.r nal
of Molecular Biology, 391, 552-64

Baum, B., Muley L., Smolinski M., Heine A., KlebeH,a ngG.a uaern,d D. (2009)
Non-additivity of Functional Group Contributionn s Priotein-ligand Binding: A Comprehensive
Study by Crystallography and Isothermal Titrataiolonr imCetry.
Journal of Molecular Biology, submitte d













Für meine Familie




Für melancholische Stunden: Was ich lernen möchte
Es gibt so viele Dinge, von denen ein
alter Mann einem erzählen müsste,
solange man klein ist; denn wenn man
erwachsen ist, wäre es selbstverständlich,
sie zu kennen.
Da sind die Sternenhimmel, und ich
weiß nicht, was die Menschen über sie
schon erfahren haben, ja, nicht einmal die
Anordnung der Sterne kenne ich.
Und so ist es mit den Blumen, mit den
Tieren, mit den einfachsten Gesetzen, die
da und dort wirksam sind und durch die
Welt gehen mit ein paar Schritten von
Anfang nach Ende.
Wie Leben entsteht, wie es wirkt in den
geringen Wesen, wie es sich verzweigt
und ausbreitet, wie Leben blüht, wie es
trägt: alles das zu lernen, verlangt mich.
Durch Teilnahme an alledem mich
fester an die Wirklichkeit zu binden, die
mich so oft verleugnet, - dazusein, nicht
nur dem Gefühle, sondern auch dem
Wissen nach, immer und immer, das ist
es, glaube ich, was ich brauche, um
sicherer zu werden und weniger
heimatlos.

Rainer Maria Rilke

Für den Res t: Wer?Wie?Was? Wieso?Weshalb?Warum?
Wer nicht fragt, bleibt dumm.
Tausend tolle Sachen, die gibt es überall zu sehn.
Manchmal muss man fragen um sie zu verstne.h
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG UND AUFGABENSTELLUNG ............................................................. 9
1.1 Wirkstoffdesign ......................................................................................................... 9
1.2 Aufgabenstellung .................................................................................................... 13
1.3 Die Zielstruktur Thrombin ........................................................................................ 14
1.4 Die Inhibitorenserie UB_THR .................................................................................. 16
1.5 Thermodynamik der Protein-Ligand Wechselwirkung.............................................. 20
1.5.1 Enthalpische Bindungsbeiträge .......................................................................................... 24
1.5.2 Entropische Bindungsbeiträge ............................................................................................ 25
1.5.3 Enthalpie-Entropie-Kompensation ...................................................................................... 27
1.5.4 Die Diskussion thermodynamischer Daten ......................................................................... 30
1.5.5 Isothermale Titrationskalorimetrie (ITC) ............................................................................. 31
1.5.6 Röntgenkristallographisch bestimmte B-Werte als Indikator für dynamische Parameter .. 37
1.5.7 Die Bedeutung thermodynamischer Daten für das strukturbasierte Wirkstoffdesign ......... 39
1.6 Thrombin als Zielmolekül für das Wirkstoffdesign ................................................... 43
1.6.1 Physiologische Grundlagen: Das System der Blutgerinnung [67] ...................................... 43
1.6.2 Medikamentöse antithrombotische Therapie ...................................................................... 47
1.6.3 Forschung nach neuen Antikoagulantien ........................................................................... 51
1.6.4 Ausblick – in vivo veritas ..................................................................................................... 56
2 ERGEBNISSE UND DISKUSSION ........................................................................ 57
2.1 Der Thermodynamische Referenzzustand .............................................................. 57
2.2 Tabellarische Zusammenfassung aller gemessenen Daten .................................... 60
2.2.1 Beurteilung der Datenqualität ............................................................................................. 66
2.3 Diskussion von Enthalpie-Entropie-Kompensation .................................................. 67
2.4 More than a simple lipophilic contact: A detailed thermodynamic analysis of nonbasic
residues in the S1-pocket of Thrombin ........................................................................ 69
2.5 Think twice: Understanding the high potency of bis-phenyl methane inhibitors of
thrombin ...................................................................................................................... 82
2.6 Cooperativity in Ligand Binding ............................................................................... 96
2.7 Untersuchungen zum Protonierungszustand der Inhibitoren ................................. 107
2.8 Kristallstrukturen weiterer Thrombin-Inhibitoren .................................................... 110
2.8.1 Der KNOBLE-Inhibitor MM18 ........................................................................................... 110
2.8.2 Der duale Faktor Xa- und Thrombininhibitor MI-0002 ...................................................... 112
2.8.3 Der Inhibitor MI-0008 ........................................................................................................ 115
2.9 Isothermale Titrationskalorimetrie mit Ligandengemischen ................................... 117
3 SUMMARY AND PERSPECTIVE ........................................................................ 123
4 EXPERIMENTAL PART ................................................................................... 126
4.1 Kinetic Assay ........................................................................................................ 126
4.2 Microcalorimetry (ITC) ........................................................................................... 126
4.3 Crystallography ...................................