Culture de cellules animales (3° Éd.)

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Description

La 3e édition de ce livre de référence a bénéficié d’une refonte complète et d’une augmentation substantielle pour tenir compte des avancées accumulées pendant les onze années écoulées depuis la précédente édition.

Après un premier chapitre retraçant l’historique de la culture cellulaire de 1907 à nos jours, l’ouvrage se divise en cinq grandes parties :

● la biologie et l’environnement des cellules en culture, rappel des données essentielles de biologie cellulaire

● les techniques et méthodes, indispensables à connaître et maîtriser

● la pharmacotoxicologie in vitro, ou comment la survie ou la fonction d’une cellule peut être préservée ou mise en danger

● les systèmes intégrés et cultures spécialisées : partie centrale de l’ouvrage consacrée aux modèles cellulaires provenant des différents systèmes ou organes et à leurs progrès impressionnants, leurs applications majeures et les indispensables protocoles qui s’y rattachent

● les autres modèles issus de bivalves marins, de poissons ou d’arthropodes.

Enfin, le dernier chapitre se penche sur les questions éthiques, sociales et juridiques qui encadrent et délimitent l’utilisation des cellules et tissus d’origine humaine et les techniques et progrès scientifiques associés.


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Ajouté le 23 octobre 2014
Nombre de lectures 425
EAN13 9782743069896
Langue Français
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Nouvelle édition
entièrement réactualisée
Georgia Barlovatz-Meimon
Xavier Ronot
LE LIVRE
eLa 3 édition de ce livre de référence a bénéfi cié d’une refonte complète et d’une
augmentation substantielle pour tenir compte des avancées accumulées pendant les onze Culture années écoulées depuis la précédente édition.
Après un premier chapitre retraçant l’historique de la culture cellulaire de 1907 à nos
jours, l’ouvrage se divise en cinq grandes parties :
● la biologie et l’environnement des cellules en culture, rappel des données
essentielles de biologie cellulaire de cellules
● les techniques et méthodes, indispensables à connaître et maîtriser
● la pharmacotoxicologie in vitro, ou comment la survie ou la fonction d’une cellule
peut être préservée ou mise en danger
● les systèmes intégrés et cultures spécialisées : partie centrale de l’ouvrage
consacrée aux modèles cellulaires provenant des différents systèmes ou organes animales
et à leurs progrès impressionnants, leurs applications majeures et les indispensables
protocoles qui s’y rattachent
● les autres modèles issus de bivalves marins, de poissons ou d’arthropodes. e3 édition
Enfi n, le dernier chapitre se penche sur les questions éthiques, sociales et juridiques
qui encadrent et délimitent l’utilisation des cellules et tissus d’origine humaine et les
techniques et progrès scientifi ques associés.
LES AUTEURS
Ce travail de plus d’une centaine de chercheurs, spécialistes de biologie cellulaire,
d’une méthode ou d’un modèle, a été coordonné par Georgia Barlovatz-Meimon,
Professeure des Universités, Laboratoire IBISC (Informatique Biologie Intégrative
et Systèmes Complexes) à Evry, et Xavier Ronot, Directeur d’Études à l’École Pratique
des Hautes Études, Laboratoire CaCyS (Cancer, Cycle cellulaire et Sénescence)
à Grenoble.
LE PUBLIC
Enseignants, chercheurs, étudiants en sciences biologiques, techniciens et ingénieurs.
Il intéressera également tout organisme formateur dans ce domaine en constante
progression, en particulier pour se conformer aux directives européennes REACH.
978-2-7430-1989-1editions.lavoisier.fr
Georgia Barlovatz-Meimon
Culture de cellules animales
Xavier Ronot
e
3 éditionCulture de cellules
animales
e3 éditionChez Lavoisier Tec & Doc :
Cycle cellulaire et cytométrie en fux, par Didier Grunwald, Jean-François Mayol et Xavier Ronot
La cytométrie en fux , par Xavier Ronot, Didier Grunwald, Jean-François Mayol et Jean Boutonnat
Communications et signalisations cellulaires, par Yves Combarnous
eL’évolution biologique au XXI siècle : Les faits, les théories, par Roger Dajoz
Biologie de l’évolution et médecine (Coll. Monographies), par Christian Frelin et Bernard Swynghedauw
Labo-Stat : Guide de validation des méthodes d’analyse, par Max Feinberg
Chez Lavoisier Médecine Sciences :
Biologie moléculaire de la cellule, par B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts et P. Walter
Biologie moléculaire de la cellule – Livre d’exercices, par J. Wilson et T. Hunt
L’essentiel de la biologie cellulaire, par B. Alberts, D. Bray, K. Hopkin, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts
et P. Walter
Immunologie, par L. Chatenoud et J.-F. Bach
Manuel de poche de biologie cellulaire, par H. Plattner et J. Hentschel
Biologie moléculaire et médecine, par J.-C. Kaplan et M. Delpech
Appareils et méthodes en biochimie et biologie moléculaire, par B. Hainque, B. Baudin et P. Lefebvre
Biochimie et biologie moléculaire, par P. Kamoun, A. Lavoinne et H. de Verneuil
Histologie, par J.-P. DadouneGeorgia BarLovaTz-MeiMon Xavier ronoT
Culture de cellules
animales
e3 édition
Préface de Monique Adolphe
Postface de Jacques Demongeot
editions.lavoisier.frLes auteurs déclarent ne pas avoir de confit d’intérêt concernant le contenu de cet ouvrage.
Ouvrage réalisé avec le concours de l’Inserm
(Institut national de la santé et de la recherche médicale)
Couverture :
Photo 1 : Visualisation des flaments d’actine dans un doigt de migration d’un tissu MDCK. (Crédit : cliché O. Cochet)
Photo 2 : Cellules provenant d’un adénocarcinome mammaire, MDA-MB-231. Au cours d’un test de migration après blessure in vitro, on
note la présence de PAI-1 (en vert) dans de petits bourgeonnements membranaires. (Crédit : collection Michel Malo, laboratoire IBISC)
®Photo 3 : Photographie de cellules cultivées sur microporteur. Cellules rénales humaines sur Cytodex 3. (Crédit : cliché CNRS-Laboratoire
Réactions et Génie des Procédés, Nancy)
Photo 4 : Cellules RT112 (lignée dérivée d’une tumeur vésicale humaine). Marquage en fuorescence de la tubuline (vert) et de l’ADN (bleu).
(Crédit : collection Véronique Frachet, laboratoire CaCyS, EPHE)
Photo 5 : Culture de pneumocytes de type II isolés de poumon de rat fœtal qui se transforment en pneumocytes I en 48h sur plastique (en
vert la protéine TIα) (Crédit : cliché Bernadette Chailley-Heu)
Photo 6 : Explant de cochlée de souris. Sur cette portion, on visualise les cellules ciliées (rouge, marquage myosine 7a), les neurones auditifs
et les fbres nerveuses (vert, marquage neuroflament 200). (Crédit : cliché Florence François)
Direction éditoriale : Fabienne Roulleaux
Édition : Brigitte Peyrot
Fabrication : Estelle Perez-Le Du
Composition et couverture : Patrick Leleux PAO, Caen
Impression et brochage : L.E.G.O. S.p.a., Lavis, Italie
© 2014, Lavoisier, Paris
ISBN : 978-2-7430-1989-1LiSTe DeS CoLLaBoraTeUrS
AberdAm Daniel, Directeur de Recherche Inserm, UMRS976, Hôpital Saint-Louis, Paris.
AlfAidy Nadia, Chargée de Recherche Inserm, Laboratoire Biologie du Cancer et de l’Infection, Unité Mixte
INSERM-CEAUJF U1036, Institut de Recherches en Technologies et Sciences pour le Vivant, CEA-Grenoble, Université Joseph
Fourier, Grenoble.
AndréAu Karine, Maître de Conférences, Laboratoire des Réponses Moléculaires et Cellulaires aux Xénobiotiques, Unité
Biologie Fonctionnelle et Adaptative, CNRS UMR 8251, Université Paris-Diderot, Paris.
AuxenfAns Céline, Praticien Hospitalier, Laboratoire des Substituts Cutanés, Banque de Tissus et Cellules, Hôpital Édouard
Herriot, UMR5305, IBCP, Lyon.
bAezA-squibAn Armelle, Professeure des Universités, Laboratoire des Réponses Moléculaires et Cellulaires aux Xénobiotiques,
Unité de Biologie Fonctionnelle et Adaptative, UMR CNRS 8251, Université Paris-Diderot, Paris.
bArlovAtz-meimon Georgia, Professeure des Universités, Laboratoire IBISC (Informatique, Biologie Intégrative et Systèmes
Complexes), Université d’Évry-Val d’Essonne/Genopole, Évry.
bArtholin Laurent, Chargé de Recherche Inserm, UMR Inserm 1052, CNRS 5286, Université Lyon 1, Centre de Recherche en
Cancérologie de Lyon, Centre Léon Bérard, Lyon.
blAnchArd Fabrice, Ingénieur de Recherche, Laboratoire Réactions et Génie des Procédés, UMR CNRS 7274, ENSAIA,
Vandœuvre-lès-Nancy.
bongrAnd Pierre, Professeur des Universités, Praticien Hospitalier, Laboratoire Adhésion Cellulaire et Infammation, Inserm
UMR1067, CNRS UMR 7333, Université Aix-Marseille, Marseille.
boublik Yvan, Ingénieur de Recherche CNRS, UMR 5237 CNRS, Centre de Recherches de Biochimie Macromoléculaire
(CRBM), Montpellier.
bourbon Jacques, Directeur de Recherche CNRS, Inserm U955, Institut Mondor de Recherche Biomédicale, Créteil.
brocArd Jacques, Chargé de Recherche Inserm, Institut de Neurosciences, Centre de Recherche Inserm U836, Grenoble.
brouillet Sophie, Assistante Hospitalo-Universitaire, Laboratoire d’Aide à la Procréation-CECOS, Centre Hospitalier
Universitaire de Grenoble, Université Joseph Fourier, Grenoble.
cAlvo Fabien, Professeur des Universités, Praticien Hopitaliler, Service de Pharmacologie, Centre d’Investigations
Cliniques, Inserm UMRS 940 Hôpital Saint-Louis, Paris.
cAmbAr Jean, Professeur des Universités, Laboratoire de Biologie Cellulaire, FRE CNRS 3396 Pharmacochimie, UFR des
Sciences Pharmaceutiques, Université Bordeaux-Segalen, Bordeaux.
cArtier-michAud Amandine, Post-doctorante, CRCM Marseille, Equipe Adhésion et Interactions Tumeur/Hôte, Marseille.
cerutti Martine, Directrice de Recherche CNRS, UP33044, Baculovirus et Thérapie, Saint Christol-lès-Alès.
chArrière-bertrAnd Cécile, Maître de Conférences, Université Paris-Est Créteil, et laboratoire IBISC (Informatique, Biologie
Intégrative et Systèmes Complexes), Évry.
chevAlot Isabelle, Professeure des Universités, Université de Loraine, Laboratoire Réactions et Génie des Procédés, UMR
CNRS 7274, ENSAIA, Vandœuvre-lès-Nancy.
cochet-escArtin Olivier, Docteur, Laboratoire Physicobiologie aux Mésoéchelles, UMR 168, Institut Curie, Centre de
Recherche CNRS UPMC, Paris, France. Physics Department, University of California, San Diego, USA.
corre Guillaume, Chercheur/Post-doctorant, UMR Inserm U951 Immunologie Moléculaire et Biothérapies Innovantes,
Généthon, Université d’Évry-Val d’Essonnes, École Pratique des Hautes Études, Évry.
cousserAns François, Ingénieur d’Études, UMR1333 INRA - DGIMI, Université Montpellier 2, Montpellier.
curtet-benitski Sandrine, Assistante Ingénieure, Inserm U823, Épigénétique et Signalisation Cellulaire, Institut Albert
Bonniot, La Tronche.
vdAmour Odile, Praticien Hospitalier, Laboratoire des Substituts Cutanés, Banque de Tissus et Cellules, Hôpital Édouard
Herriot ; UMR5305, IBCP, Lyon.
de guerrA Arnaud, Responsable Pôle Recherche et Union européenne, Direction Médicale et Scientifque, Agence de la
Biomédecine, Saint-Denis La Plaine.
deugnier Marie-Ange, Chargée de Recherche Inserm, Institut Curie, Centre de Recherche, CNRS UMR144, Mécanismes
Moléculaires du Développement de la Glande Mammaire, Paris.
di-cicco Amandine, Assistante Ingénieure, Institut Curie, Centre de Recherche, CNRS UMR144, Mécanismes Moléculaires
du Développement de la Glande Mammaire, Paris.
dorAnge Germaine, Professeure des Universités, UFR Médecine et Sciences de la Santé, Département Génie biologique, IUT
Brest, Université de Bretagne Occidentale, Brest.
dos sAntos Morgan, Docteur, Laboratoire des Substituts Cutanés, Banque de Tissus et Cellules, Hôpital Édouard Herriot,
Lyon.
droguet Mickael, Maître de Conférences des Universités, UFR Médecine et Sciences de la Santé, Département Génie
biologique, IUT Brest, Université de Bretagne Occidentale, Brest.
ducArouge Benjamin, Post-doctorant, UMR 5286 Équipe Apoptose Cancer et Développement, Centre de Recherche en
Cancérologie de Lyon, Centre Léon Bérard, Lyon.
dugAil Isabelle, Directrice de Recherche Inserm, UMRS U1166, Équipe 6 Nutriomics, Inserm, Paris.
dupont Joëlle, Directrice de Recherche INRA, UMR Physiologie de la Reproduction et des Comportements, Centre
Val-deLoire, Tours.
dupressoir Thierry, Professeur des Universités, Directeur d’Études Laboratoire de Pathologie Comparée des Invertébrés,
École Pratique des Hautes Études, UMR1333 INRA - DGIMI, Université Montpellier 2, Montpellier.
edom-vovArd Frédérique, Post-doctorant, Centre de Recherche en Myologie, UMRS974 UPMC, Inserm, FRE 3617
CNRSAIM, Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière, Paris.
fAbre Isabelle, Chef du pôle Contrôles biologiques des produits biologiques et des plantes, Direction des Contrôles, Agence
Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM), Vendargues.
feige Jean-Jacques, Directeur de Recherche Inserm, Laboratoire Biologie du Cancer et de l’Infection, Unité Mixte
INSERMCEA-UJF U1036, Institut de Recherches en Technologies et Sciences pour le Vivant, CEA-Grenoble, Université Joseph
Fourier, Grenoble.
filiputti-gilquin Anne-Laure, Assistante Ingénieure, Responsable Culture Cellulaire, Société CreaCell, La Tronche.
frAboulet Sandrine, Maître de Conférences des Universités, UFR Chimie-Biologie, Université Joseph Fourier, Grenoble.
frAnçois Florence, Ingénieure d’Études, Institut des Neurosciences de Montpellier, Inserm U1051, Montpellier.
freshney Ian, PhD, honorary Senior Research Fellow, Center for Oncology and Applied Pharmacology, part of the Cancer
Research UK Beatson Laboratories, University of Glasgow, Royaume-Uni.
froment Pascal, Chargé de Recherche INRA, UMR Physiologie de la Reproduction et des Comportements, Centre
Val-deLoire, Tours.
fromigué Olivia, Chargée de Recherche Inserm, Inserm UMR 981, Université Paris Sud, Institut Gustave Roussy, Villejuif.
gAbillArd Jean-Charles, Chargé de Recherche INRA, UR1037, Laboratoire de Physiologie et Génomique des Poissons, Rennes.
gAboyArd-niAy Sophie, Chef de Projet R&D, Sensorion, Institut des Neurosciences de Montpellier, Montpellier.
girodon François, Professeur des Universités, Praticien Hospitalier, Service d’Hématologie Biologique, Centre Hospitalier
Universitaire de Dijon et Université de Bourgogne, Dijon.
grunwAld Didier, Ingénieur/Chercheur, iRTSV, CEA, Grenoble.
guedon Emmanuel, Chargé de Recherche CNRS, Laboratoire Réactions et Génie des Procédés, UMR CNRS 7274, ENSAIA,
Vandœuvre-lès-Nancy.
guguen-guillouzo Christiane, Directrice de Recherche Émérite, Inserm U991 Foie, Métabolisme et Cancer, Université de
Rennes 1, Rennes.
guyot Mélanie, Docteur, IPMC, Université de Nice-Sophia Antipolis, Nice.
vi LISTE DES COLLABORATEURShAbert René, Professeur des Universités, UMR Inserm U967-CEA, Université Paris-Diderot, Sorbonne Paris-Cité, Laboratoire
de Développement des Gonades, Centre CEA, Fontenay-aux-Roses.
hoffmAnn-cucuz Pascale, Professeure des Universités, Praticien Hospitalier, Service de Médecine de la Reproduction,
Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble ; Laboratoire Biologie du Cancer et de l’Infection, Unité Mixte
InsermCEA-UJF U1036, Institut de Recherches en Technologies et Sciences pour le Vivant, CEA-Grenoble, Université Joseph
Fourier, Grenoble.
JAcquier-sArlin Muriel, Maître de Conférences, Institut des Neurosciences, Inserm U836, Université Joseph Fourier,
Grenoble.
kAdri Malika, Technicienne, Laboratoire Cancer Cycle cellulaire et Sénescence (CaCyS), FRE AGIM 3405 UJF-CNRS-EPHE,
Université Joseph Fourier, Grenoble.
klemAn Jean-Philippe, Chercheur, Institut de Biologie Structurale, UMR 5075 CNRS/CEA, Université Joseph Fourier,
Grenoble.
l’Azou Béatrice, Maître de Conférences, Laboratoire de Biologie Cellulaire, UFR des Sciences Pharmaceutiques, Université
Bordeaux-Segalen, Inserm 1026 Bioingénierie Tissulaire, Bordeaux.
lAiné Michèle, Maître de Conférences, Institut des Neurosciences, Inserm U836, Université Joseph Fourier, Grenoble.
lArdeux Bernard, Chargé de Recherche CNRS, Institut des Maladies de l’Appareil Digestif, Inserm U913, Centre Hospitalier
Universitaire Hôtel-Dieu, Nantes.
legendre Audrey, Ingénieure-Chercheur, Institut de Radioprotection et de Sûreté Nucléaire (IRSN), Laboratoire de
Toxicologie Expérimentale, Fontenay-aux-Roses.
leguen Isabelle, Chargée de Recherche INRA, UR1037, Laboratoire de Physiologie et Génomique des Poissons, Rennes.
lemAzurier Emmanuel, Chef de Projets, Institut National de l’Environnement et des Risques (INERIS), Verneuil-en-Halatte.
liverA Gabriel, Professeur des Universités, UMR Inserm U967-CEA, Université Paris-Diderot, Sorbonne Paris-Cité,
Laboratoire de Développement des Gonades, Centre CEA, Fontenay-aux-Roses.
loyer Pascal, Chargé de Recherche, Inserm UMR 991 Foie, Métabolisme et Cancer, Hôpital Pontchaillou, Rennes.
mAguer-sAttA Véronique, Directrice de Recherche CNRS, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, U1052-UMR5286,
Université Lyon 1, Lyon.
mAlo Michel, Maître de Conférences, Université d’Évry-Val d’Essonne, et laboratoire IBISC (Informatique, Biologie
Intégrative et Systèmes Complexes), Évry.
mArc Annie, Directrice de Recherche CNRS, Laboratoire Réactions et Génie des Procédés, UMR CNRS 7274, ENSAIA,
Vandœuvre-lès-Nancy.
mArie Pierre, Directeur de Recherche CNRS, Inserm UMR 1132 et Université Paris-Diderot, Sorbonne Paris-Cité, Hôpital
Lariboisière, Paris.
mArtel-frAchet Véronique, Maître de Conférences, École Pratique des Hautes Études, Laboratoire Cancer Cycle cellulaire
et Sénescence (CaCyS), FRE AGIM 3405 UJF-CNRS-EPHE, Grenoble.
mAynAdié Marc, Professeur des Universités, Praticien Hospitalier, Service d’Hématologie Biologique, Centre Hospitalier
Universitaire de Dijon et Université de Bourgogne, Dijon.
mAyol Jean-François, Chief Scientifc Offcier, TransCure bioServices SAS, Biopark, Archamps Technopôle.
modrowski Dominique, Chargée de Recherche Inserm, Inserm UMR 1132 et Université Paris-Diderot, Sorbonne Paris-Cité,
Hôpital Lariboisière, Paris.
mouly Vincent, Directeur de Recherche CNRS, Centre de Recherche en Myologie, UMRS 974 UPMC, Inserm, FRE 3617
CNRS-AIM, Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière, Paris.
mourAh Samia, Praticien Hospitalier, Service de Pharmacologie, Laboratoire de Pharmacologie-Génétique, Inserm UMRS
940, Hôpital Saint-Louis, Paris.
negroni Elisa, Post-doctorante, Centre de Recherche en Myologie, UMRS 974 UPMC, Inserm, FRE 3617 CNRS-AIM, Groupe
Hospitalier Pitié-Salpêtrière, Paris.
neunlist Michel, Directeur de Recherche Inserm, Institut des Maladies de l’Appareil Digestif, Inserm U913, Centre Hospitalier
Universitaire Hôtel-Dieu, Nantes.
LISTE DES COLLABORATEURS viiolmos Eric, Maître de Conférences, Laboratoire Réactions et Génie des Procédés, UMR CNRS 7274, ENSAIA 7274,
Vandœuvrelès-Nancy.
oudAr Olivier, Professeur des Universités, Inserm U698, Unité 1148 – LVTS, Université Paris 13, Paris.
pAgès Gilles, Directeur de Recherche, Institut Cancer et Vieillissement de Nice (IRCAN) UMR CNRS 7284/U Inserm 1081,
Centre Antoine Lacassagne, Université de Nice-Sophia Antipolis, Nice.
pAin Bertrand, Directeur de Recherche, Inserm U846, USC 1361, INRA, Bron.
pAldi Andras, Professeur des Universités, UMR Inserm U951 Immunologie Moléculaire et Biothérapies Innovantes,
Généthon, Université d’Évry-Val d’Essonnes, École Pratique des Hautes Études, Évry.
pelissier-rotA Marjolaine, Doctorante, Inserm U836, Institut des Neurosciences, Grenoble.
pierres Anne, Directrice de Recherche, Laboratoire Adhésion Cellulaire et Infammation, Inserm UMR1067, CNRS UMR
7333, Université Aix-Marseille, Marseille.
pommier Roxane, Doctorante, UMR Inserm 1052, CNRS 5286, Université Lyon 1, Centre de Recherche en Cancérologie de
Lyon, Centre Léon Bérard, Lyon.
prulière-escAbAsse Virginie, Maître de Conférences des Universités, Praticien Hospitalier, Service d’ORL et de Chirurgie
Cervico-Faciale, Centre Hospitalier Intercommunal de Créteil ; Inserm U955, Institut Mondor de Recherche
Biomédicale, Créteil.
puel Jean-Luc, Professeur des Universités, Institut des Neurosciences de Montpellier, Inserm U1051, Montpellier.
quignot Nadia, Chercheur – Chef de Projets scientifques, LA-SER Analytica, Strategy & Decision Analytics, Paris.
robin Marie-Anne, Directrice de Recherche, Inserm U991 Foie, Métabolisme et Cancer, Université de Rennes 1, Rennes.
rochAis Francesca, Chargée de Recherche Inserm, IBDM UMR 7288, Marseille.
rochet Nathalie, Chargée de Recherche Inserm, FRE 3502 CNRS, Université de Nice, Faculté de Médecine, Nice.
rolli-derkinderen Malvyne, Chargée de Recherche, Institut des Maladies de l’Appareil Digestif, Inserm U913, Centre
Hospitalier Universitaire Hôtel-Dieu, Nantes.
ronot Xavier, Directeur d’Études, École Pratique des Hautes Études, Laboratoire Cancer Cycle cellulaire et Sénescence
(CaCyS), FRE AGIM 3405 UJF-CNRS-EPHE, Grenoble.
rouiller-fAbre Virginie, Professeure des Universités, UMR Inserm U967-CEA, Université Paris-Diderot, Sorbonne
ParisCité, Laboratoire de développement des Gonades, Centre CEA, Fontenay-aux-Roses.
sAlAsc Fanny, Doctorante, Laboratoire de Pathologie Comparée des Invertébrés, École Pratique des Hautes Études, UMR1333
INRA - DGIMI, Université Montpellier 2, Montpellier.
sené Sylvain, Professeur des Universités, CNRS, LIF, UMR7279, Université d’Aix-Marseille, Marseille ; Institut Rhône-alpin
des systèmes complexes, IXXI, Lyon.
silberzAn Pascal, Directeur de Recherche, Laboratoire Physico-chimie Curie, UMR 168, Institut Curie, Centre de Recherche
CNRS UPMC, Paris.
stockholm Daniel, Maître de Conférences, UMR Inserm U951 Immunologie Moléculaire et Biothérapies Innovantes,
Généthon, Université d’Évry-Val d’Essonnes, École Pratique des Hautes Études, Évry.
supirAmAniAn-thurAisAmy Ajitha, Post-doctorante, Laboratoire CRRET, Université Paris-Est Créteil.
tAlArmin Hélène, Maître de Conférences des Universités, Laboratoire de Physiologie, IUT Génie biologique, Faculté de
Médecine, Brest.
thepot Amélie, Chef de Projet R&D, Laboratoire des Substituts Cutanés, Banque de Tissus et Cellules, Hôpital Édouard
Herriot, Lyon.
vAlcourt Ulrich, Maître de Conférences, UMR Inserm 1052, CNRS 5286, Université Lyon 1, Centre de Recherche en
Cancérologie de Lyon, Centre Léon Bérard, Lyon.
vAllese Denis, Doctorant, Centre de Recherche en Myologie, UMRS 974 UPMC, Inserm, FRE 3617 CNRS-AIM, Groupe
Hospitalier Pitié-Salpêtrière, Paris.
venAil Frederic, Praticien Hospitalier Universitaire, Institut des Neurosciences de Montpellier, Inserm U1051 ; Service ORL,
Centre Hospitalier Universitaire Gui-de-Chauliac, Montpellier.
viii LISTE DES COLLABORATEURSvigouroux Clotilde, Pharmacienne, Banque de Tissus et Cellules, Hôpital Édouard Herriot, UMR5305, IBCP, Lyon.
vincent David, Post-doctorant, Beatson Institute for Cancer Research, Wnt signaling and Colorectal Cancer, Glasgow,
Royaume-Uni.
vittet Daniel, Chargé de Recherche Inserm, Laboratoire Biologie du Cancer et de l’Infection, Unité Mixte Inserm-CEA-UJF
U1036, Institut de Recherches en Technologies et Sciences pour le Vivant, CEA-Grenoble, Université Joseph Fourier,
Grenoble.
LISTE DES COLLABORATEURS iXSommaire
Liste des collaborateurs ............................................................................. V
Préface m. Adolphe .................................................................................. XXV
avant-propos g. bArlovAtz-meimon, x. ronot .......................................................... XXVII
Liste des abréviations ............................................................................... XXIX
Chapitre 1. origine de la culture de cellules i. freshney ........................................... 1
ParTie i
BioLoGie eT environneMenT DeS CeLLULeS en CULTUre
Chapitre 2. adhésion cellulaire A. pierres, p. bongrAnd.............................................. 13
Introduction ........................................................................................... 13
Les interactions adhésives régulent la quasi-totalité des fonctions cellulaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
Le comportement des cellules adhérentes dépend très signifcativement des propriétés physiques du substrat .. 14
L’adhésion cellulaire repose essentiellement sur de très nombreux récepteurs membranaires spécialisés ..... 15
Méthodes d’étude de l’adhésion cellulaire : aspects généraux.......................................... 17
Propriétés mécaniques et/ou cinétiques de l’adhésion ................................................... 17
Étude morphologique de l’adhésion cellulaire ........................................................... 20
Régulation de l’adhésion cellulaire..................................................................... 24
Régulation de la répulsion stérique ..................................................................... 24
Régulation de l’expression des récepteurs d’adhésion .................................................... 24
Régulation fonctionnelle des récepteurs d’adhésion : modifcations conformationnelles ..................... 24
Microagrégation (clustering) ........................................................................... 24
Localisation des récepteurs sur les extrémités des protrusions membranaires .............................. 25
Modifcation de l’interaction des récepteurs d’adhésion avec le cytosquelette d’actine ...................... 25
Contrôle du détachement des cellules adhérentes ..................................................... 25
Modifcations conformationnelles ...................................................................... 25
Rupture mécanique des liaisons ........................................................................ 26
Diminution de la rigidité membranaire ................................................................. 26
Protéolyse de molécules impliquées dans l’adhésion 26
Insertion d’éléments répulsifs dans la zone d’adhésion ................................................... 26
Comment l’adhésion à un substrat peut-elle modifer le comportement cellulaire ? ................... 26
Signaux engendrés par l’occupation des récepteurs d’adhésion ........................................... 26
Regroupement de quelques molécules susceptibles d’interagir pour produire un signal ..................... 27
XiGénération de forces et mécanotransduction à l’interface cellule-substrat.................................. 27
Contrôle de l’organisation du cytosquelette ............................................................. 28
Importance de l’étalement : effet de la forme sur le comportement cellulaire ............................... 28
Conclusion............................................................................................. 29
Chapitre 3. variabilité non génétique dans les cultures cellulaires g. corre, d. stockholm, A. pAldi . . . 33
Historique ............................................................................................. 33
Cellule unique et population cellulaire................................................................. 34
Fluctuations d’origine interne ......................................................................... 35
Bruit moléculaire : la loi des petits nombres ............................................................. 35
Bruit structural : compartimentation subcellulaire et dynamique chromatinienne .......................... 36
Stochasticité expression génique ....................................................................... 37
Fluctuations d’origine externe 40
Milieu nutritif et métabolisme cellulaire 40
Organisation spatiale des cellules in vitro ............................................................... 40
Variations liées aux manipulations expérimentales .................................................... 41
Maîtriser les fuctuations ............................................................................... 42
Conclusion............................................................................................. 42
Chapitre 4. aspects physiques des comportements collectifs épithéliaux o. cochet-escArtin,
p. silberzAn .............................................................................. 45
Structure et régulation du tissu épithélial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Mouvements collectifs de tissus in vivo................................................................ 47
Étude de mouvements collectifs de tissus in vitro ..................................................... 48
Techniques expérimentales ............................................................................ 48
Particularités du mouvement collectif................................................................... 50
Polarisation du mouvement collectif .................................................................... 54
Études théoriques de la migration collective ........................................................... 55
Modèles continus ..................................................................................... 55
Modèles discrets ...................................................................................... 55
Conclusion............................................................................................. 58
Chapitre 5. Défs de la culture de cellules animales en bioréacteur A. mArc, e. guedon,
e. olmos, f. blAnchArd, i. chevAlot ......................................................... 61
Principaux réacteurs en mode agité 61
Différents modes d’alimentation du milieu de culture .................................................... 61
Systèmes de culture placés en incubateur ............................................................... 62
Bioréacteurs contrôlés ................................................................................. 62
Infuence de l’environnement cellulaire 63
Du milieu avec sérum jusqu’au milieu chimiquement défni .............................................. 63
Méthodes de criblage de la formulation du milieu de culture.............................................. 64
Éléments nutritifs solubles ............................................................................. 64
Gaz dissous........................................................................................... 65
Paramètres physicochimiques.......................................................................... 65
Culture des cellules sur microporteurs ................................................................. 65
Différents types de supports ........................................................................... 65
Principaux paramètres opératoires ..................................................................... 65
Expansion cellulaire en système de culture agité ......................................................... 67
Analyses et régulations en ligne sur le bioréacteur ..................................................... 67
Mesure et régulation de la température ................................................................. 67
Mesure et régulation de la concentration en oxygène dissous ............................................. 67
Xii SOMMAIREMesure et régulation de la concentration en dioxyde de carbone dissous................................... 68
Mesure et régulation du pH ............................................................................ 69
Nouveaux outils d’analyse en ligne .................................................................... 69
Analyse des cellules ................................................................................... 69
Analyse des composés solubles......................................................................... 69
Chapitre 6. Sphéroïdes o. oudAr................................................................... 71
Défnition, historique, intérêts, avantages .............................................................. 71
Obtention, caractérisation des sphéroïdes ............................................................. 72
Protocoles ............................................................................................. 75
Formation des sphéroïdes ............................................................................. 75
Transfert et culture cellulaire........................................................................... 75
Conclusion 76
Chapitre 7. Dynamique du microenvironnement cellulaire A. supirAmAniAn, A. cArtier-michAud,
c. chArrière-bertrAnd, m. mAlo, g. bArlovAtz-meimon ........................................ 77
De la matrice extracellulaire au microenvironnement ................................................. 77
Le microenvironnement évolue avec le dialogue cellules/matrice ..................................... 78
Le « matrisome » humain .............................................................................. 79
La matrice extracellulaire, une combinatoire aux rôles pléiotropiques 83
Un acteur exemplaire du dialogue cellule/matrice, la fbronectine ......................................... 83
La dynamique du microenvironnement constitue un système complexe ................................... 86
Une dynamique particulière : le microenvironnement tumoral ........................................ 87
Exploration de toutes ses facettes....................................................................... 87
Les nouveaux venus du micro environnement : exosomes, microvésicules et autres « débris cellulaires » ...... 94
L’exemple de PAI-1, frein ou promoteur de la migration cellulaire et acteur direct de la transition
mésenchymo-amaeboïde (MAT)........................................................................ 96
Conclusion............................................................................................. 102
Annexes................................................................................................ 110
Chapitre 8. Bonnes pratiques de culture cellulaire s. curtet-benitski, A.-L. filiputti-gilquin ......... 118
Matières premières .................................................................................... 118
Cellules .............................................................................................. 119
Milieux, additifs et réactifs ............................................................................. 120
Consommables ....................................................................................... 121
Matériels............................................................................................... 121
Postes de sécurité microbiologique ..................................................................... 121
Incubateurs à CO .................................................................................... 1222
Centrifugeuses ........................................................................................ 123
Autres équipements ................................................................................... 123
Main-d’œuvre ......................................................................................... 123
Formation du personnel ............................................................................... 123
Hygiène et sécurité 124
Milieu : le laboratoire de culture cellulaire ............................................................. 124
Niveaux de sécurité biologique et organisation .......................................................... 124
Désinfection des locaux ............................................................................... 124
Évacuation des déchets ................................................................................ 124
Méthodes .............................................................................................. 125
Conclusion............................................................................................. 126
Annexe................................................................................................. 127
SOMMAIRE XiiiChapitre 9. Cryopréservation des cellules x. ronot, M. kAdri, V. mArtel-frAchet ..................... 128
Aspects physicochimiques de la formation des cristaux................................................ 128
Effets biophysiques de la formation de glace........................................................... 129
Déshydratation cellulaire .............................................................................. 129
Stress mécanique ..................................................................................... 129
Cristallisation intracellulaire ........................................................................... 129
Choc thermique ...................................................................................... 129
Effets biologiques de la formation de glace ............................................................ 129
Agents cryoprotecteurs ................................................................................ 131
Conditions de congélation ............................................................................. 132
Matériel cellulaire ..................................................................................... 132
Identifcation des cryotubes pour l’archivage 132
Dispositifs de congélation.............................................................................. 132
Cryoconservateurs .................................................................................... 132
Congélation à −80 °C .................................................................................. 133
Décongélation ......................................................................................... 133
Hygiène et sécurité 134
Congélation sans sérum ............................................................................... 134
Conservation de courte durée . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
Transport des cellules ................................................................................. 134
Conclusion ............................................................................................ 135
Annexe ................................................................................................ 136
ParTie ii
TeChniqUeS eT MéThoDeS
Chapitre 10. viabilité, cytotoxicité, génotoxicité A. bAezA-squibAn, k. AndréAu ....................... 139
Méthodes d’étude de la viabilité cellulaire ............................................................. 140
Approches morphologiques ............................................................................ 140
Méthodes de quantifcation de la viabilité cellulaire ...................................................... 140
Quantifcation des cellules mortes par la perte d’intégrité de la membrane plasmique ................ 143
Méthodes utilisant l’exclusion de colorants vitaux........................................................ 143
Méthodes utilisant la libération d’enzymes intracellulaires................................................ 143
Détection couplée des cellules mortes et des cellules vivantes ......................................... 144
Cytotoxicité : étude spécifque des différentes voies de mort cellulaire ................................. 144
Classifcation des différents types de mort cellulaire 144
Détection et mesure spécifque de l’apoptose ............................................................ 144
Détection et mesure spécifque de la nécrose régulée ..................................................... 149 l’autophagie .......................................................... 149
Méthodes d’étude de la prolifération cellulaire ........................................................ 149
Dénombrement des cellules ........................................................................... 149
Quantifcation des acides nucléiques ................................................................... 149
Incorporation d’un précurseur de l’ADN ................................................................ 150
Mesure de l’impédance électrique cellulaire ............................................................. 150
Étude du cycle cellulaire ............................................................................... 150
Méthodes d’étude de la génotoxicité : le test des comètes ............................................. 150
Conclusion............................................................................................. 151
Xiv SOMMAIREChapitre 11. apport de la cytométrie en fux à la culture cellulaire J.-f. mAyol.................... 153
Principe de la cytométrie en fux ....................................................................... 153
Réseau fuidique ...................................................................................... 153
Système optique 153
Interface informatique................................................................................. 155
Différents types de marquages ......................................................................... 155
Anticorps............................................................................................. 155
Sondes ............................................................................................... 156
Transfection .......................................................................................... 156
Compensations de fuorescence ........................................................................ 157
Interprétation des résultats ............................................................................ 157
Régions et conditionnement des graphes................................................................ 157
Pourcentages ......................................................................................... 157
Valeurs absolues ...................................................................................... 157
Intensités de fuorescence ............................................................................. 158
Applications ........................................................................................... 159
Caractérisation phénotypique de sous-populations présentes ............................................. 159
Mesure d’une intensité de fuorescence ................................................................. 159
Étude de la viabilité, de la mort cellulaire ............................................................... 159
Cycle cellulaire et prolifération . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
Fonctions cellulaires .................................................................................. 163
Cellules souches ...................................................................................... 164
Biologie végétale ...................................................................................... 164
Microbiologie, virologie................................................................................ 165
Tri cellulaire .......................................................................................... 165
Nouveaux développements ............................................................................ 165
Chapitre 12. imagerie cellulaire J.-p. klemAn, d. grunwAld .......................................... 168
Préservation du vivant ................................................................................. 168
Conditions de culture et maintien de l’homéostasie ...................................................... 168
Maintien de la température 169
Milieux de culture spécifques, maintien du pH .......................................................... 169
Stress radiatifs, stress oxydatifs ......................................................................... 170
Microscopes pour l’observation des cellules vivantes .................................................. 170
Principes généraux de la microscopie ................................................................... 170
Microscopie optique .................................................................................. 172
Microscopie de fuorescence ........................................................................... 174
Dépasser les limites techniques de la résolution optique............................................... 185
Chapitre 13. Transfert de gènes dans les cellules en culture p. loyer ............................. 188
Défnitions et historique du transfert de gènes ......................................................... 188
Transfert horizontal de gènes : le modèle bactérien ...................................................... 190
Captation d’ADN par les cellules d’eucaryotes en culture ................................................. 190
Transfection d’ADN par des molécules polyanioniques : lipofection et polyfection .......................... 191
Transfection par procédés physiques ................................................................... 191
Transfert de gènes par infection virale : la transduction................................................... 192
Plasmides et génomes viraux modifés pour le transfert de gènes .......................................... 193
Transfection, transduction, oligonucléotides antisens et ARN interférence ................................. 195
Applications du transfert d’acides nucléiques dans les cellules en culture ............................. 195
Études de la fonction des gènes et des protéines ......................................................... 196
Établissement de lignées cellulaires recombinantes 202
Thérapie génique ex vivo .............................................................................. 205
Choix méthodologique du transfert de gènes : quels outils pour quelles applications ? ................ 205
Études de séquences régulatrices de la transcription et de la maturation des ARN .......................... 206
SOMMAIRE XvLocalisation subcellulaire de protéines et identifcation de leurs partenaires ................................ 206
Impact de la surexpression accrue et de l’extinction de gènes sur les cellules en culture ..................... 207
Établissement de lignées cellulaires recombinantes ...................................................... 208
Chapitre 14. Méthodes informatiques en biologie g. bArlovAtz-meimon, s. sené ..................... 217
Vision globale de la bio-informatique actuelle ......................................................... 218
Bio-informatique des séquences........................................................................ 218
Bio-informatique des structures 220
Bio-informatique des réseaux .......................................................................... 221
Traitement de l’information............................................................................ 223
Une application traditionnelle : la phylogénie ........................................................... 224
Réseaux et modélisation ............................................................................... 225
Modélisation théorique : le cas des réseaux d’automates.................................................. 226
Modélisation appliquée................................................................................ 230
Conclusion............................................................................................. 232
Annexes................................................................................................ 235
ParTie iii
PharMaCoToXiCoLoGie in vitro
Chapitre 15. voies de signalisation majeures impliquées dans la survie et la prolifération
cellulaire m. guyot, g. pAgès .......................................................... 241
Généralités sur le fonctionnement du couple ligands/récepteurs ...................................... 241
Différents modes de transmission du signal ........................................................... 243
Récepteurs membranaires majeurs .................................................................... 244
Récepteurs à activité tyrosine kinase .................................................................... 244
Récepteurs couplés aux protéines G 245
Récepteurs des cytokines couplés à la kinase JAK ........................................................ 245
Récepteurs du Transforming Growth Factor b (TGFb) ................................................... 246
Voies de signalisation principales ...................................................................... 247
Voie de l’AMP cyclique (AMPc) ......................................................................... 247
Voie de la phospholipase C (PLC)....................................................................... 247
Voie de la phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) .......................................................... 248
Voies des Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK) .................................................... 248
Modifcations pathologiques ........................................................................... 251
Convergence, divergence et interférence entre les différentes voies de signalisation ......................... 252
Conclusion............................................................................................. 252
Chapitre 16. De la cible à la molécule s. mourAh, f. cAlvo ......................................... 255
Angiogenèse tumorale ................................................................................. 255
Mécanisme de l’angiogenèse tumorale................................................................. 255
« Switch » angiogénique ............................................................................... 255
Processus de l’angiogenèse tumorale ................................................................... 256
Les facteurs VEGF et leurs récepteurs (VEGFR) ........................................................ 257
VEGF (VEGF-A) ....................................................................................... 257
Récepteurs des VEGF .................................................................................. 258
Activités biologiques du système VEGF/VEGFR .......................................................... 258
Les anti-angiogéniques ................................................................................ 258
Objectifs de la thérapie anti-VEGF ...................................................................... 259
®Bevacizumab (Avastin ) ............................................................................... 259
Xvi SOMMAIREParTie iv
SySTèMeS inTéGréS eT CULTUreS SPéCiaLiSéeS
Chapitre 17. Cellules souches ...................................................................... 263
Cellules souches et cellules souches embryonnaires b. pAin........................................... 263
Totipotence et clonage ................................................................................ 263
Pluripotence et cellules souches embryonnaires ......................................................... 264
Conclusion ........................................................................................... 267
La niche des cellules souches : enjeux conceptuels et technologiques pour l’étude des mécanismes
normaux et tumoraux v. mAguer-sAttA, n. rochet ..................................................... 269
Concepts et problématiques ........................................................................... 269
Exemple de modélisation de la niche osseuse en culture 3D au sein d’un biomatériau ...................... 277
Conclusion générale et perspectives .................................................................... 285
Chapitre 18. ingénierie de la cornée : vers des modèles de plus en plus complexes
c. vigouroux, o. dAmour, d. AberdAm, c. AuxenfAns.......................................... 291
Modèles 3D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291
Épithélium pluristratifé sans stroma . . . . 291
Épithélium avec stroma (hémi-cornée) ................................................................. 292
Cornée reconstruite complète ......................................................................... 293
Sources potentielles de cellules capables de se différencier en cellules épithéliales de cornée humaine . . . 294
Cellules souches embryonnaires humaines (hESC) ....................................................... 294
Cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPS) ................................................. 294
Chapitre 19. La peau reconstruite : un outil d’étude de pharmacotoxicologie et de création
d’un modèle in vitro m. dos sAntos, A. thepot, o. dAmour, c. AuxenfAns .................. 297
De la peau humaine aux équivalents cutanés : motivations ayant suscité leur développement ........ 297
Modèles simples développés pour les tests d’innocuité ................................................ 298
Modèles tridimensionnels et tests d’effcacité .......................................................... 299
Peaux reconstruites dans les matrices d’origine humaine ou animale ...................................... 299
Peaux reconstruites dans une matrice biologique d’origine biosynthétique ................................. 300
Création de modèle in vitro : exemple du vieillissement ............................................... 302
Modifcations chimiques du support .................................................................... 302
Modifcations biologiques ............................................................................. 303
Conclusion............................................................................................. 303
Chapitre 20. Culture de cellules nerveuses J. brocArd, s. frAboulet ................................. 305
Cultures primaires de cellules nerveuses............................................................... 305
Phylogénie des cellules nerveuses ...................................................................... 305
Neurones du système nerveux central................................................................... 307
Neurones granulaires du cervelet : un modèle de migration............................................... 307
Autres cellules nerveuses en culture ................................................................... 308
Lignées cellulaires..................................................................................... 308
Différenciation de cellules souches ..................................................................... 309
Cas des cellules humaines ............................................................................. 309
Modifcations de cultures matures ..................................................................... 309
Substrats et supports .................................................................................. 311
Transfection/infection................................................................................. 312
Protocoles ............................................................................................. 313
Considérations générales .............................................................................. 313
Culture de ganglions spinaux de poulet ................................................................. 314
Culture de neurones hippocampiques ou corticaux ...................................................... 314
SOMMAIRE XviiCulture de neurones granulaires de cervelet ............................................................. 315
Co-cultures à partir de neurosphères ................................................................... 316
Transfection au phosphate de calcium .................................................................. 317
Chapitre 21. Muscle squelettique : structure, origine et techniques de culture cellulaire
f. edom-vovArd, d. vAllese, e. negroni, v. mouly ............................................ 319
Structure et origine du muscle squelettique............................................................ 319
Structure du muscle squelettique adulte : les fbres musculaires ........................................... 319
Origine du muscle squelettique ........................................................................ 320
Cellules satellites...................................................................................... 322
Technique de culture cellulaire ........................................................................ 325
Complexité de l’organe ................................................................................ 325
Pourquoi utiliser les cultures de cellules ? ............................................................... 325
Cultures primaires .................................................................................... 326
Lignées et immortalisation............................................................................. 327
Fibres isolées ......................................................................................... 329
Culture en trois dimensions (3D) ....................................................................... 329
Chapitre 22. Cellules cardiaques f. rochAis ....................................................... 333
Introduction ........................................................................................... 333
Structure et fonction du cœur .......................................................................... 333
Développement du cœur .............................................................................. 334
Cellule cardiaque ..................................................................................... 336
Cultures de cellules cardiaques ........................................................................ 337
Quelques rappels historiques........................................................................... 338
Isolement et culture primaire de cellules cardiaques ..................................................... 338
Lignées cellulaires établies ............................................................................. 342
Cardiomyocytes issus de cellules souches pluripotentes .................................................. 343
Cultures de modèles complexes........................................................................ 344
Culture d’explants..................................................................................... 344
Ingénierie tissulaire ................................................................................... 344
Conclusion............................................................................................. 344
Chapitre 23. Culture de cellules endothéliales : applications à l’étude de l’angiogenèse
d. vittet, s. brouillet, p. hoffmAnn, n. AlfAidy, J.-J. feige .................................... 347
Fonctions et propriétés physiologiques de l’endothélium vasculaire ................................... 347
Angiogenèse ........................................................................................... 348
Caractérisation des cellules endothéliales.............................................................. 348
Morphologie.......................................................................................... 348
Marqueurs cellulaires ................................................................................. 349
Protocoles de préparations de cultures cellulaires endothéliales (méthodes d’isolement).............. 350
Cellules macrovasculaires. Exemple des cellules endothéliales humaines de la veine ombilicale (HUVEC)..... 351
Cellules microvasculaires. Exemple des cellules endothéliales humaines placentaires (HPEC)................ 352
Préparations commerciales ............................................................................ 353
Intérêt des cultures de cellules endothéliales .......................................................... 353
Modèles 2D (bidimensionnels) d’angiogenèse ........................................................... 353
Modèles 3D (tridimensionnels) d’angiogenèse ........................................................... 354
Perspectives futures des cultures de cellules endothéliales............................................. 357
Chapitre 24. Culture de cellules ostéoblastiques p. mArie, d. modrowski, o. fromigué ............... 360
Origine et différenciation des ostéoblastes ............................................................. 360
Obtention de cellules ostéoblastiques.................................................................. 361
Cellules provenant du stroma médullaire................................................................ 361
Xviii SOMMAIRECellules dérivées de l’os ............................................................................... 362
Autres sources de cellules de type ostéoblastique ........................................................ 362
Ostéocytes............................................................................................ 362
Lignées cellulaires..................................................................................... 362
Utilisation des cellules ostéoblastiques ................................................................ 363
Études phénotypiques ................................................................................. 363
Études phénotypiques ex vivo.......................................................................... 364
Applications thérapeutiques des cellules ostéoblastiques .............................................. 366
Analyse transcriptomique et protéomique............................................................... 366
Thérapie cellulaire et génique 366
Conclusions et perspectives............................................................................ 368
Chapitre 25. Système hématopoïétique m. mAynAdié, f. girodon ................................... 372
Hématopoïèse ......................................................................................... 372
Localisation de l’hématopoïèse......................................................................... 372
Cellules de l’hématopoïèse............................................................................. 372
Microenvironnement ou stroma médullaire ............................................................. 374
Facteurs régulateurs de l’hématopoïèse ................................................................. 375
Cultures de cellules hématopoïétiques................................................................. 377
Cultures et érythropoïèse .............................................................................. 377
Techniques de cultures ................................................................................ 377
Les différents types de cellules cultivables ............................................................... 378
Exemples d’application des cultures cellulaires .......................................................... 378
Chapitre 26. hépatocytes et foie : modèles de référence et nouvelles approches stratégiques
m.-A. robin, c. guguen-guillouzo ......................................................... 382
Cultures primaires d’hépatocytes issus de parenchyme hépatique adulte.............................. 383
Nécessité de déstructurer le tissu par digestion enzymatique : principe et bilan fonctionnel ................. 383
Cultures primaires en monocouche (2D) ................................................................ 384
Modulation fonctionnelle par les facteurs environnementaux ............................................. 385
Obtention et différenciation d’hépatocytes à partir de cellules souches ................................ 390
Cellules souches d’origine tissulaire adulte .............................................................. 390
Cellules souches embryonnaires (ESC) .................................................................. 390
Lignées cellulaires immortalisées et/ou transformées.................................................. 393
Lignées d’hépatomes issues de tumeurs................................................................. 393
Lignée humaine HepaRG ............................................................................. 394
Lignées d’hépatocytes immortalisées 397
Innovations technologiques............................................................................ 397
Développement de microsystèmes ou « puces » à cellules .............................................. 397
Cultures tridimensionnelles (3D) ...................................................................... 398
Structuration de bioréacteurs avec fuidique associée .................................................. 398
Applications des modèles hépatiques in vitro ......................................................... 398
Étude des fonctions hépatiques et de leur régulation ................................................... 398
Étude du métabolisme et de la toxicité des xénobiotiques .............................................. 399
Applications thérapeutiques .......................................................................... 402
Chapitre 27. Système intestinal B.  ducArouge, m. pelissier-rotA, m. rolli-derkinderen, b. lArdeux,
m. lAiné, m. neunlist, m. JAcquier-sArlin ................................................... 409
Généralités sur le système digestif ..................................................................... 409
Principales populations cellulaires de l’épithélium digestif ............................................ 412
Cellules souches et organoïdes ......................................................................... 414
Cellules prolifératives des cryptes (cellules non transformées)............................................. 416
Cellules épithéliales intestinales immortalisées .......................................................... 418
SOMMAIRE XiXCellules différenciées dérivées des villosités intestinales (cellules non transformées) ........................ 419
Lignées d’adénocarcinomes : modèles de la différenciation épithéliale..................................... 420
Régulation des fonctions de la barrière épithéliale ..................................................... 426
Par le mésenchyme et la matrice extracellulaire.......................................................... 426
Par le système nerveux entérique ....................................................................... 433
Conclusion............................................................................................. 440
Chapitre 28. Cultures de cellules rénales b. l’Azou, J. cAmbAr ...................................... 448
Rappels ................................................................................................ 448
Structure et fonctions du rein .......................................................................... 448
Cibles des principaux xénobiotiques .................................................................... 451
Techniques des cultures cellulaires rénales ............................................................ 454
Modèles rénaux in vitro complexes ..................................................................... 454
Différents types de cultures de cellules.................................................................. 456
Cultures de cellules glomérulaires ...................................................................... 456
Cultures de cellules vasculaires corticales rénales ........................................................ 461
Cultures de cellules tubulaires.......................................................................... 462
Cultures et complexifcation des modèles .............................................................. 467
Conclusion............................................................................................. 469
Chapitre 29. Culture de cellules épithéliales respiratoires v. prulière-escAbAsse, J. bourbon ......... 476
Organisation et fonctions des épithéliums du tractus respiratoire chez les mammifères ............... 476
Description morphologique ............................................................................ 476
Fonctions de l’épithélium mucociliaire des voies de conduction........................................... 479
Fonctions de l’épithélium alvéolaire .................................................................... 485
Modèles de culture primaire des cellules épithéliales des voies aériennes de conduction .............. 487
Culture d’explants..................................................................................... 487
Culture de cellules dissociées .......................................................................... 487
Épithélium respiratoire humain reconstitué en xénogreffe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 489
Modèles de culture primaire des cellules épithéliales alvéolaires....................................... 489
Isolement et purifcation ............................................................................... 489
Maintien des pneumocytes en culture primaire : milieux et supports de culture ............................ 490
Lignées cellulaires épithéliales respiratoires ........................................................... 493
Lignées exprimant un phénotype cellulaire des voies de conduction 494
Lignées exprimant un phénotype cellulaire alvéolaire .................................................... 495
Dérivation in vitro de cellules épithéliales respiratoires à partir de cellules souches ................... 496
Applications des cultures de cellules épithéliales respiratoires ......................................... 497
Chapitre 30. Culture cellulaire de testicule et d’ovaire pour l’étude de la fonction
de reproduction p. froment, n. quignot, A. legendre, v. rouiller-fAbre, g. liverA,
J. dupont, r. hAbert, e. lemAzurier ........................................................ 502
Fonction de reproduction.............................................................................. 502
Fonction testiculaire .................................................................................. 502
Fonction ovarienne ................................................................................... 508
Développement des gonades .......................................................................... 512
Cultures cellulaires testiculaires ....................................................................... 516
Modèles d’études fondamentales in vitro ............................................................... 516
Protocoles de culture de cellules testiculaires ............................................................ 518
Cultures cellulaires ovariennes......................................................................... 528
Modèles cellulaires .................................................................................... 528
Protocoles de culture de cellules ovariennes ............................................................. 529
XX SOMMAIREChapitre 31. Culture primaire de cellules pancréatiques exocrines de souris.
Un outil indispensable pour la compréhension de l’étiologie de la carcinogenèse
pancréatique u. vAlcourt, r. m. pommier, d. f. vincent, l. bArtholin ..................... 544
Biologie du pancréas................................................................................... 545
Culture des cellules acineuses dispersées ou d’acini dispersés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 548
Isolement et culture d’acini dispersés.................................................................. 549
Considérations générales et précautions ................................................................ 549
Protocole............................................................................................. 550
Analyse du phénotype des cellules pancréatiques primaires ........................................... 555
Extraction des protéines ............................................................................... 556
Extraction des acides ribonucléiques messagers ......................................................... 556
Analyse du phénotype des cellules...................................................................... 557
Protocoles complémentaires d’isolement et de culture des cellules acineuses pancréatiques .......... 558
Concentration en acides aminés........................................................................ 558
Importance du pH .................................................................................... 558
Méthode de Sphyris et al. (2005) ....................................................................... 558
Méthode de Bläuer et al. (2011) : culture organotypique .................................................. 559
Conclusion............................................................................................. 561
Chapitre 32. Culture de cellules de l’oreille interne de mammifère : de la physiopathologie
à la thérapie f. frAnçois, s. gAboyArd-niAy, J.-l. puel, f. venAil ............................ 564
Cultures de cellules de cochlée ........................................................................ 564
Culture organotypique d’explant de cochlée ............................................................. 565
Culture organotypique de tranche de cochlée............................................................ 565
Applications des cultures organotypiques de cochlée..................................................... 566
Cultures primaires de vestibule 567
Les différentes techniques ............................................................................. 568
Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 569
Conclusion............................................................................................. 570
Chapitre 33. Caractéristiques moléculaires et propriétés fonctionnelles des cellules épithéliales
mammaires A. di-cicco, m.-A. deugnier ............................................... 572
Développement de la glande mammaire............................................................... 572
Caractéristiques moléculaires des cellules épithéliales mammaires .................................... 572
Organisation et marqueurs spécifques de l’épithélium mammaire ........................................ 572
Fractionnement des cellules épithéliales mammaires et analyse par cytométrie en fux ...................... 573
Interactions paracrines ................................................................................ 575
Propriétés fonctionnelles des cellules épithéliales mammaires......................................... 575
Potentiel régénératif et clonogénique des cellules basales/myoépithéliales ................................. 575
Activité clonogénique des cellules luminales............................................................. 576
Conclusion............................................................................................. 576
Chapitre 34. Système adipocytaire i. dugAil ...................................................... 578
Fonction des adipocytes ............................................................................... 578
Modèles adipocytaires en culture ...................................................................... 579
Pré-adipocytes de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux .......................................... 579
Lignées adipocytaires.................................................................................. 580
Conditions de culture 580
Milieux de culture..................................................................................... 581
Exigences en sérum ................................................................................... 581
Repiquages ........................................................................................... 581
Induction de la différenciation, contrôles de qualité...................................................... 582
SOMMAIRE XXiTransfert de gènes .................................................................................... 582
Intérêt des cultures d’adipocytes....................................................................... 582
ParTie v
aUTreS MoDèLeS
Chapitre 35. Cultures primaires de cellules cardiaques de bivalves marins g. dorAnge, m. droguet,
h. tAlArmin ............................................................................. 587
Espèces cibles.......................................................................................... 588
Choix du cœur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 589
Anatomie et structure du cœur ........................................................................ 589
Anatomie............................................................................................. 589
Structure ............................................................................................. 589
Physiologie ........................................................................................... 592
Cultures primaires de cellules cardiaques.............................................................. 592
Prélèvement du cœur.................................................................................. 592
Isolement des cellules cardiaques ...................................................................... 594
Conditions de culture ................................................................................. 595
Évolution des cultures ................................................................................. 595
Croissance cellulaire .................................................................................. 597
Capacité fonctionnelle des cellules cardiaques en culture................................................. 599
Essais de subculture................................................................................... 600
Cryopréservation des cellules isolées .................................................................. 601
Quelques exemples d’application des cultures en toxicologie .......................................... 602
Effet de l’acide okadaïque sur les cellules cardiaques de palourde ......................................... 602
Effet du tributylétain sur des cardiomyocytes d’huître .................................................... 603
Effet du cadmium sur les cardiomyocytes d’huître ....................................................... 604
Conclusion............................................................................................. 604
Chapitre 36. Cultures primaires de branchies et de muscles de truite arc-en-ciel i. leguen,
J.-c. gAbillArd........................................................................... 607
Conditions de culture cellulaire pour poissons téléostéens ............................................ 607
Culture primaire de branchies de truite................................................................ 607
Isolement des cellules branchiales ...................................................................... 608
Culture sur support solide ............................................................................. 609
Culture sur support perméable ......................................................................... 609
Culture primaire de cellules satellites de truite......................................................... 611
Méthode d’extraction des cellules satellites de truite ..................................................... 612
Caractérisation des cellules satellites en culture.......................................................... 612
Chapitre 37. enjeux fondamentaux et biotechnologiques de la culture des cellules
d’arthropodes f. cousserAns, y. boublik, f. sAlAsc, m. cerutti, t. dupressoir ................ 615
Pourquoi cultiver des cellules d’arthropodes ? ......................................................... 615
Génomique structurale ................................................................................ 615
Génomique fonctionnelle .............................................................................. 615
Modèles animaux ..................................................................................... 616
eLa culture de cellules d’arthropodes existe depuis le début du 20 siècle............................... 616
Culture de cellules d’arthropodes et agents infectieux .................................................... 616
« Montée en puissance » des cultures de cellules d’arthropodes ........................................... 617
Spécifcités techniques 618
XXii SOMMAIREProduction de protéines hétérologues et/ou recombinantes ........................................... 620
Les différents systèmes ................................................................................ 620
« Humanisation » des systèmes de production de protéines recombinantes en cellules d’insecte ...... 623
Glycosylation dans les cellules d’insecte................................................................. 623
« » de la voie de biosynthèse des N-glycanes ............................................... 624
Perspectives .......................................................................................... 626
Production de particules virales........................................................................ 627
Vaccins .............................................................................................. 627
Vecteurs.............................................................................................. 629
Conclusion............................................................................................. 630
ParTie vi
LéGiSLaTion
Chapitre 38. aspects éthiques et réglementaires de l’utilisation des cellules, tissus et produits du
corps humain : applications aux études in vitro i. fAbre, A. de guerrA ................................ 639
Législation : historique des lois relatives à la bioéthique ............................................... 639
Les premières lois de bioéthique ....................................................................... 639
Sanctions en cas d’infractions en matière d’éthique médicale ............................................. 641
Organes ................................................................................................ 641
Prélèvements à fns scientifques sur personnes décédées ................................................ 642
Tissus, cellules, produits du corps humain et dérivés .................................................. 642
Dispositions communes ............................................................................... 642
Prélèvement et collecte 642
Autorisation des établissements effectuant les prélèvements .............................................. 643
Préparation, conservation et utilisation des tissus, des cellules et de leurs dérivés .......................... 643
Recherche sur l’embryon et les cellules souches embryonnaires ....................................... 644
Autres modèles cellulaires prospectifs issus d’éléments du corps humain : un cadre législatif
moins contraignant .................................................................................... 644
Cellules souches adultes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 644
Cellules souches pluripotentes induites ................................................................. 645
Textes relatifs à l’importation et à l’exportation d’organes, de tissus et de cellules du corps humain... 645
Pour les organes ...................................................................................... 645
Pour les tissus, cellules ................................................................................ 645
Brevetabilité des éléments du corps humain et de ses dérivés ......................................... 646
Directive européenne relative à la protection juridique des inventions biotechnologiques ................... 646
Encadrement juridique communautaire et international dans les différents domaines
de la bioéthique........................................................................................ 646
Droit communautaire ................................................................................. 646
Droit international .................................................................................... 647
Conclusion............................................................................................. 647
Postface – Considérations éthiques sur l’usage futur des cultures cellulaires J. demongeot ......... 649
index ................................................................................................ 663
SOMMAIRE XXiiiPréface
Dans cette troisième édition de Culture de cellules animales, je vois un passé amical, un présent scientifquement
remarquable et un futur que l’on devine porteur de progrès.
Passé amical : la première édition est née du dynamisme conjoint de Georgia Barlovatz-Meimon et de moi-même
accompagnées d’une petite équipe où était déjà présent Xavier Ronot. Cette première édition n’existerait pas sans
l’aiguillon effcace de Georgia et le travail des enseignants enrôlés par le laboratoire de l’EPHE dans le cycle d’études de
Pharmacotoxicologie cellulaire, qui a formé jusqu’en 1997 de nombreux « cultivateurs cellulaires » français ou francophones.
Cette première édition épuisée, une deuxième a vu le jour et aujourd’hui une troisième édition apparaît, compte tenu
des progrès considérables des cultures cellulaires et de la volonté toujours aussi forte des deux coordinateurs Georgia et
Xavier.
Oui, le présent des cultures cellulaires montre une avancée fulgurante et le nombre des chapitres de cette troisième
édition en fait foi.
On y trouve de très nombreux auteurs. Quelques rares de la première édition (comme Jean Cambar dans les cultures
de cellules rénales, Isabelle Dugail dans le système adipocytaire, Christiane Guillouzo dans le système hépatique et Pierre
Marie dans le chapitre des ostéoblastes), et de nombreux nouveaux dont certains, je m’en souviens, ont fait carrière en
France avec l’aide de nos deux premières éditions.
Ce développement considérable est très bien résumé dans l’historique de Ian Freshney qui cite le rôle utile de l’ETCS
(European Tissue Culture Society) à ses débuts mais qui s’est effondré au début de sa mondialisation avec l’ouverture au
Japon. Mais la Société américaine de culture de tissus dont j’ai fait aussi partie n’a pas joué le jeu et le seul reproche que je
ferai à l’historique de mon ami Ian Freshney est de ne citer que des auteurs anglo-saxons, alors qu’en Europe et en France
nous n’avions pas de retard.
Le contenu de cette troisième édition est excellent car il démontre à l’évidence, en particulier dans sa partie I, tous les
progrès technologiques des cultures qui ont abouti à une meilleure connaissance des interactions cellulaires en relation
avec le microenvironnement et tout ce que cela sous-entend. Mais ces avancées technologiques sont également notables
dans la partie méthodologique. Citons les études de cytotoxicité, les nouvelles applications de la cytométrie en fux (dont
Xavier Ronot a été le promoteur dans notre laboratoire) et en particulier dans la mise en évidence des cellules souches qui
ne représentent que 0,0005 % de la population cellulaire et qui, avec la transduction de gènes, a révolutionné des pans
considérables de la biologie et de la thérapeutique. Enfn un chapitre nouveau par rapport à la précédente édition sur la
bio-informatique que Georgia Barlovatz-Meimon a pris en charge avec son sens inné de l’importance de ces méthodologies
qui changent la culture cellulaire comme notre société.
La partie IV développe les cultures spécialisées et leur intégration dans des systèmes de plus en plus complexifés.
Chaque chapitre est très complet et, dans la majorité des types cellulaires, on est frappé par l’importance de
l’immortalisation cellulaire et surtout des cellules souches modifées par transfection de gènes pour en faire des modèles dont l’intérêt
va de la biologie à la thérapie régénérative.
Remarquons, d’une part, que la plupart des types cellulaires de la troisième édition ont été repris par des auteurs
différents, ce qui démontre qu’une autre génération s’est intéressé aux cultures cellulaires, ce qui me réjouit.
D’autre part de nouveaux types cellulaires ont été développés : cellules pancréatiques, cellules de l’oreille interne,
cellules mammaires, ainsi que les cellules cardiaques de bivalves marins qui se sont ajoutées aux cellules de branchies de
poisson de la deuxième édition, démontrant le développement de l’écotoxicologie marine sur des modèles ex vivo. Enfn
les cultures d’arthropodes sont aussi nouvelles dans cette édition bien que les auteurs affrment que leur existence est déjà
XXvancienne. Ceci est important car, si l’augmentation de la population mondiale conduit, comme on l’entend dire, les
générations futures à manger des insectes, les cultures d’insectes deviendront essentielles.
Encore bravo à Georgia Barlovatz-Meimon et Xavier Ronot et merci de m’avoir permis de parcourir ce nouveau livre
pour en rédiger la préface.
Monique Adolphe
[Monique Adolphe fut, en France, une pionnière de la culture cellulaire
qu’elle a utilisée pour des études de pharmaco-toxicologie.
Première Présidente de l’École Pratique des Hautes Etudes,
elle est membre de l’Académie Nationale de Médecine, section des Sciences Pharmaceutiques.
Elle a également innové comme première femme élue Présidente de l’Académie Nationale de Pharmacie, en 2009.]
XXvi PRÉF A CEavant-propos
La troisième édition de Culture de cellules animales s’inscrit naturellement dans la suite des parutions de 1988 puis
2003, aux éditions Inserm. Novatrice, cette édition intègre la constante évolution du domaine et s’appuie sur l’émergence
de nouveaux modèles cellulaires in vitro.
Particulièrement opportun, cet ouvrage rassemble des compétences et des approches multiples avec pour objectif
majeur d’apporter à la communauté scientifque une vision, non exhaustive mais très accomplie, des différents aspects de la
culture cellulaire : biologie et environnement, méthodes et techniques, pharmacotoxicologie, systèmes intégrés et cultures
spécialisées, nouveaux modèles (cellules de cochlée, de bivalves marins ou d’arthropodes), questions éthiques, sociales et
juridiques. Nous espérons en donner un réel et solide aperçu et fournir au lecteur l’essentiel des éléments pour se conformer
aux directives européennes REACH.
Une bibliographie, parfois consistante, clôt chaque chapitre et invite le lecteur à consulter les articles d’auteurs dont
la notoriété est incontestable.
Cette nouvelle édition s’affche résolument attractive : entièrement en couleur, les schémas, dessins et photos de cel -
lules cultivées illustrent chaque chapitre et apportent l’information scientifque complémentaire au texte.
Culture de cellules animales n’aurait pu voir le jour sans le généreux concours et l’engagement d’un grand nombre
d’experts. Nous souhaitons exprimer ici notre gratitude à tous les auteurs pour le travail considérable qu’ils ont fourni, pour
leur enthousiasme mais également pour leurs encouragements et leur disponibilité.
« L’imprévisible est dans la nature même de l’entreprise scientifque.
Si ce qu’on va trouver est vraiment nouveau, alors c’est par défnition quelque chose d’inconnu à l’avance . »
(François Jacob)
Georgia bArlovAtz-meimon, xavier ronot
XXviiListe des abréviations
AAP alamine aminopeptidase Bim B-cell lymphoma 2 interacting
AAV adenovirus associated virus mediator of cell death
ABP androgen binding protein BMP bone morphogenetic proteins
AC adénylate cyclase BMSCbone marrow mesenchymal stem cell
ACTH adrenocorticotrophic hormone BPAburst promoting activity
ADAM A disintegrin and metalloproteinase BrdU 5-bromo-2’-désoxyuridine
ADD1/SREBP1c adipocyte determination and BRET bioluminescence resonance energy
differentiation factor 1/sterol transfer
regulatory element binding protein 1cBSA bovine serum albumine
ADH antidiuretic hormone BSPbone sialoprotein
ADN acide désoxyribonucléique BTC banque de tissus et cellules
ADNc ADN complémentaire CAMcell adhesion molecules
AGEadvanced glycosylation end products CAT chloramphénicol acétyltransférase
AgT antigène T CBCcolumnar crypt based cells
AIFapoptosis-inducing factor CBT calmodulin binding peptide
AINS anti-infammatoires non stéroïdiens CC10 (ou CCSP) Clara cell secretory protein
ALDH aldéhyde déshydrogénase CCDcharge coupled device
ALP alcaline phosphatase CCPcomplement control protein
AMH anti-Müllerian hormone Cdk4cyclin dependent kinase-4
AMP adénosine 5’ monophosphate C/EBPCAAT/enhancer binding protein
AMPc adénosine monophosphate cyclique CFDA carboxyfuorescéine diacétate
α2-MR α2-macroglobulin receptor CFTR cystic fbrosis transmembrane
ANFatrial natriuretic factor conductance regulator
ANG1 angiopoïétine 1 CFU-E colony-forming unit erythroid
AOTF acousto-optic tunable flter CFU-Eocolony-forming unit eosinophil
APC allophycocyanine CFU-GEMM colony-forming unit granulocyte-
APUD amine precursor uptake and erythroid-macrophage-megakaryocyte
decarboxylation CFU-GM
ARandrogen receptor monocyte
ARN acide ribonucléique CFU-L colony-forming unit lymphocyte cells
ARNi ARN interférant CFU-Megcolony-forming unit megakaryocyte
ARNm ARN messager (identique à CFU-MK)
ARNsi petit ARN interférent CFU-mixcolony-forming unit mixture
ARPP Agence de Régulation Professionnelle CFU-MK
de la Publicité CGRP calcitonin gene-related peptide
α-SMA alpha-smooth muscle actin CLSMconfocal laser scanning microscopy
ATCC American type culture collection CMEchee medium with EGF
ATF3activating transcription factor 3 CMF cytométrie en fux
ATP adénosine-5’-triphosphate CMPcommon myeloid progenitor
Bcl-2B-cell lymphoma 2 COC complexes cumulo-ovocytaires
BCP phosphate de calcium biphasé COL1A1 collagène de type I a1
BET bromure d’éthidium Co-Smad common-partner Smad
bFGF basic fbroblast growth factor COX cyclooxygénase
BFPbiomembrane force probe CRDcarbohydrate-recognition domain
BFU-Eburst-forming unit erythroid CRE cAMP responsive element
BFU-MKburst-forming unit megakaryocyte CREBcAMP responsive element binding
bHLHbasic helix-loop-helix protein
BHT barrière hémato-testiculaire CREMcAMP responsive element modulator
Bid BH3 interacting-domain death agonist CSE cellule souche embryonnaire
BiFC bimolecular fuorescence CSFcolony-stimulating factor
complementation CSL cellules souches limbiques
XXiXCSM cellule souche mésenchymateuse FRET Förster resonance energy transfer
CSN cellule souche neurale FRLEfetal rat lung epithelium
CSP (ou CC10) Clara cell secretory protein FSHfollicle-stimulating hormone
CTGF connective tissue growth factor 5-FU 5-fuoro-uracile
CX43 connexine 43 G3PDH glycéraldéhyde-3-phosphate
CXCR4CXC-chemokine receptor 4 déshydrogénase
CYP cytochrome P450 GAP GTPase activating protein
CYR-61cysteine-rich angiogenic inducer 61 GCSFgranulocyte colony-stimulating factor
DAB diéthylaminobenzidine GDFgrowth differentiation factor
DAG diacylglycérol GDNFglial-derived neurotrophic factor
DAPK1 death-associated protein kinase 1 GDP guanosine 5’-diphosphate
DCFH-DAdichloro-dihydro-fuorescein diacetateGEFguanine nucleotide exchange factor
DDRdiscoidin domain receptor GEF guanosine nucleotide exchange factor
DES diéthylstilbestrol GFAPglial fbrillary acidic protein
DHEA déhydroépiandrostérone GFPgreen fuorescent protein
DHT dihydrotestostérone GHgrowth hormone
DIC differential interference contrast GLEPP-1glomerular epithelial protein 1
DISCdeath-inducing signaling complex GM-CSFgranulocyte macrophage
colonyDLVO Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek stimulating factor
DMEMDulbecco’s modifed Eagle’s medium GnRH gonadotropin releasing hormone
DMP1dentin matrix protein 1 GNT-I/-IIN-acétylglucosaminyltransférase I/II
DMSO diméthylsulfoxyde GPCRG protein-coupled receptor
DNMT ADN méthyltransférase GRB2growth factor receptor-bound
DOF depth of feld protein 2
dpcdays post coïtum GRP gastrin-releasing peptide
DPPC dipalmitoyl-phosphatidylcholine GST glutathione S-transférase
DSLMdigital scanned laser microscopy g-GT gamma glutamyl-tranférase
DUSPdual specifcity phosphatase GTP guanosine 5’-triphosphate
E11/GP38 podoplanine GWASgenome wide association studies
EB embryoid body HA hydroxyapatite
EC cellules embryonnaires de carcinomes HAT histones acétyltransférase
ECVAMEuropean Center for the Validation of HBSS Hank’s balanced salt solution
Alternative Methods hCG hormone chorionique gonadotrope
EDTAethylenediaminetetraacetic acid HCShematopoietic stem cell
EdU 5-éthynyl-2´-désoxyuridine HCShigh content screening
EGF epidermal growth factor HDAC histones désacétylase
EGFRepidermal growth factor receptor HES hématoxyline éosine safran
EGTAethylene glycol tetraacetic acid hESC human embryonic stem cell
EMAEuropean Medicines Agency H-FABPheart-type fatty acid-binding protein
EMCCDelectron multiplying CCD hFeTAhuman fetal testis assay
ENDOG endonucléase G HGFhepatocyte growth factor
EPI équipement de protection individuel HGPhuman genome project
EpiSC epiblast stem cells HIEChuman intestinal epithelial cell
EPO érythropoïétine HIF hypoxia inductible factor
ER estrogènes hiPShuman induced pluripotent stem
ERK1extracellular-regulated kinase 1 hMADShuman multiptent adipose derived
EROD 7-éthoxyrésorufne-O-dééthylase stem cell
ES embryonic stem HMGhigh mobility group
FACSfuorescence activated cell sorting hOSThuman osteoblasts
FAKfocal adhesion kinase HPV human papilloma virus
FasL Fas ligand HSPheat schock protein
FBSfetal bovine serum hTERThuman telomerase reverse
FETAfetal testis assay transcriptase
FGFfbroblast growth factor HUVEChuman umbilical vein endothelial cell
FITC fuorescein isothiocyanate IBMX3-isobutyl-1-methylxanthine
Flk-1fetal liver kinase 1 ICAM intercellular cell adhesion molecule
Flt-1fms-like tyrosine kinase 1 ICLACInternational cell line authentication
FPALMfuorescence photo-activated committee
localization microscopy ICMintern cellular mass
FRAPfuorescence recovery after ICSIintracytoplasmic sperm injection
photobleaching IEC intestinal epithelial cells
XXX LISTE DES ABRÉVIATIONSIGF insulin growth factor MHC myosin heavy chain
IL interleukine MIF (ou MMIF) macrophage migration inhibitory
IMDMIscove modifed Dulbecco’s medium factor
IP iodure de propidium MIP-1amacrophage infammation protein-1a
IP inositol triphosphate inositol-1,4,5- MIV maturation ovocytaire in vitro3
trisphosphate MKP MAPK phosphatase
iPS induced pluripotent stem MLC myosin light chain
IRMinterference refection microscopy MLEmurine lung epithelial
ITRinverted terminal repeat MLOmurine long bone osteocyte
ITSinsuline transferrine et sélénium MMA méthymétacrylate
IVG interruption volontaire de grossesse MMPmatrix metalloproteinase
IVSin vitro spermatogenesis MOImultiplicity of infection
IkB inhibiteur de NF- kB MPL myeloproliferative leukemia
JAK janus kinase MPPmultipotent progenitor
JAMjunctional adhesion molecule MRFmyogenic regulatory factor
JNKc-jun terminal kinase MSCmesenchymal stem cell
jpc jour post-conception mTORmammalian target of rapamycin
jpp jour post-partum
MTT3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5KDRkinase insert domain-containing diphenyltetrazolium bromide
receptor MTX méthotrexate
KGF keratinocyte growth factor NAG N-acétyl-bêta-D-glusosaminidase
KIM-1kidney injury molecule 1 NB nombre brut
KOknock out NBT/BCIP nitro-blue tetrazolium chloride
KSRknockout serum replacement associé au 5-bromo-4-chloro-3-indolyl
LAM leucémie aiguë myéloïde phosphate
LAP leucine amino-peptidase NCAM neural cell adhesion molecule
LDH lactate déshydrogénase NGALneutrophil gelatinase-associated
LFA lymphocyte function associated lipocalin
L-FABPliver-type fatty acid-binding protein NGFnerve growth factor
LHluteinizing hormone NRKnormal rat kidney
LIFleukemia inhibitory factor ON ostéonectine
LMC leucémie myéloïde chronique OPN ostéopontine
LPS lipopolysaccharide PAI-1 plasminogen activator inhibitor type 1
LRP low density lipoprotein receptor- PAL phosphatase alcaline
related protein PALMphoto-activated localization
LTBPlatent TGF binding protein microscopy
LTRlong terminal repeat PAMPpathogen-associated molecular
LUTlook up table pattern
MAdCAMmucosal adressin cell adhesion PAT process analytical technologies
molecule PBSphosphate buffered saline
MADS MCM1 agamous defciens and serum PCDEprimary culture of differentiated
response factor enterocytes
MAGPmicrofbril-associated glycoprotein PCRpolymerase chain reaction
MAP1-LC3microtubule-associated protein 1 light PDGFplatelet-derived growth factor
chain 3 PDGFR platelet-derived growth factor receptor
MAPK mitogen activated protein kinase PDK1/2 3-phosphoinositide-dependent protein
MAPK2 mitogen activated protein kinase kinase 1/2
kinase PDMS polydiméthylsiloxane
MAP3K PE phosphatidyléthanolamine
kinase kinase PECAM platelet endothelium cell adhesion
MCP-1 monocyte chemotactic peptide 1 molecule
M-CSFmonocyte colony-stimulating factor PEG polyéthylène glycol
MDCKmadin darby canine kidney PG phosphatidylglycérol
MDSCmyeloid-derived suppressor cell PGP9.5protein gene product 9.5
MEC matrice extracellulaire PH pleckstrin homology
MEF2 myocyte enhancer factor 2 PHEXphosphate-regulating gene with
MEPEmatrix extracellular homology to endopeptidases on X
phosphoglycoprotein chromosome
mESmurine ES PI3K phosphatidylinositol-3-kinase
mFeTAmouse fetal testis assay PID proportionnel – dérivé – intégral
MFI mean or median fuorescence intensity PIP phosphatidylinositol-4,5-diphosphate2
LISTE DES ABRÉVIATIONS XXXiPIP phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate siARN petit ARN interférent 3
PIV particle image velocimetry SIM structured illumination microscopy
PK protéine kinase SmurfSmad ubiquitin regulatory factor
PLB phospholamban SNE système nerveux entérique
PLLA/PHBVpoly(L-lactic acid)/poly(3- SNPsingle nucleotide polymorphism
hydroxybutyrate-co-3- SOS son of sevenless
hydroxyvalerate) SOST sclérostine
PMSG pregnant mare serum gonadotropin SPARC secreted protein acidic and rich in
PMTphoto-multiplier tube cysteine osteonectine
PN progéniteur neuronal SPLIsecretory leukocyte proteinase
pN piconewton inhibitor
POSTN périostine SQSTM1 séquestosome 1
POU octamer binding protein Src tyrosine kinases de la famille Src
PP2A protéine phosphatase 2A SRF serum response factor
PPARg peroxisome proliferator activated SSEAstage specifc embryonic antigen
receptor gamma STATsignal transducer and activator of
PPLOpleuropneumonia-like organisms transcription
pRB protéine du rétinoblastome STEDstimulated emission depletion
PROD 7-pentorésorufne-O-dééthylase STIsoybean trypsin inhibitor
PS phosphatidylsérine STORM stochastic optical reconstruction
PSF point spread function microscopy
PSGLP-selectin glycoprotein ligand SVF sérum de veau fœtal
PTBphosphotyrosine-binding domain TAPtandem affnity purifcation
PTENphosphatase and tensin homolog
TCP phosphate tricalcique
PTH hormone parathyroïdienne TdT terminal deoxynucleotidyl transferase
RAF Protéine RAF
TEERtransepithelial electrical resistance
RAS RAS
TEM transition épithélio-mésenchymateuse
RBP retinol binding protein
TERThuman telomerase reverse
rFeTArat fetal testis assay
transcriptase
RFIrelative fuorescence intensity
TFF-3intestinal trefoil factor 3
RICMrefection interference contrast
TGF transforming growth factor microscopy
Thy-1thymocyte differentiation antigen 1
RIP1receptor-interacting
serine/threonineTIMP-1tissue inhibitor of metalloproteinase 1protein kinase 1
TIRFtotal internal refection fuorescenceRISC RNA-induced silencing complex
TLRToll-like receptorROCKRho-associated coil-containing protein
TNC ténascine Ckinase
TNF tumour necrosis factorRPA-1renal papillary antigen-1
TNFR1tumour necrosis factor receptor-1RS réticulum sarcoplasmique
TP2transition protein 2R-Smadreceptor activated Smad
TPO trombopoïétineRTK récepteur tyrosine kinase
TSA trichostatineRUNX2 runt-related transcription factor 2
TSHthyroid stimulating hormoneRyRryanodin receptor
TUNEL TdT-mediated dUTP nick end-labelingSAGMsmall airway growth medium
u-PAurokinase type plasminogen activatorSCFstem cell factor
u-PARurokinase type plasminogen activator sCMOSscientifc-complementary metal oxide
receptorsemiconductor
VCAMvascular cell adhesion moleculeSCNT somatic cell nuclear transfer
VE-DIC video-enhanced DICSDCspinning disk confocal
VEGFvascular endothelial growth factorSDF1stromal derived factor 1
VLAvery late antigenSDH succinate déshydrogénase
VPFvascular permeability factorSE stroma équivalent
SERPIN serin protease inhibitor VWF facteur von Willebrand
Wnt wingless proteinsSH2 SRC homology 2
ShARN small hairpin RNA WT-1Wilms’ tumour 1
SHBG sex hormone binding globulin ZFNzinc fnger nuclease
SHF second heart feld Z-VAD-fmk
N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-AspShhSonic hedgehog fuorométhylkétone
XXXii LISTE DES ABRÉVIATIONSorigine de la culture
* 1de cellules
I. FRESHNEy
l’aide de trypsine et il fut montré que cette protéase pouvait On date l’origine de la culture de cellules au début du
e20 siècle (tableau 1-i). La date réelle dépend de la défni - dès lors servir pour les sous-culture routinières (Dulbecco,
1952). L’obtention de cellules par désagrégation du tissu tion qu’on donne à la culture de tissus : véritable technique
ou juste observation de tissus animaux in vitro. Il n’est pas entier, qui vint plus tard (Medawar, 1941 ; Moscona, 1952a ;
suffsant de rappeler que le tissu doit rester fonctionnel : si Rinaldini, 1958) est maintenant la méthode privilégiée pour
le muscle gastrocnémien de grenouille peut se contracter in obtenir des cultures primaires.
vitro, il ne peut néanmoins pas être considéré comme une Les sous-cultures successives de cellules normales ont
culture de tissu, sauf si l’ensemble est maintenu in vitro abouti à la conclusion d’une durée de vie limitée (Hayfick
pendant plusieurs heures. La croissance, par extension et Moorhead, 1961) et au fait que cette limitation était
même un signe de « normalité », plutôt qu’un signe d’ap-physique ou par réplication cellulaire, peut être considérée
comme l’un des critères majeurs de la culture de cellules, pauvrissement du milieu de culture (Hay et al., 1968). Si
mais cela exclurait alors les cultures d’organes pour les- de nombreux facteurs de régulation interviennent dans la
quels la survie peut être prolongée plusieurs semaines sans limitation de la vie cellulaire in vitro, le rôle des
téloméaugmentation de taille ou de composition cellulaire. rases apparaît comme majeur (Shay et al., 1994). Parmi
Murray et Kopech (Murray et Kopech, 1953) datent les nombreux essais pour immortaliser des lignées
cellul’origine de la culture de tissus en 1884 mais la plupart laires normales, initialement avec le gène Large T de SV40
des auteurs considèrent les expériences de Ross Harrison (Huschtscha et Holliday, 1983), citons l’utilisation récente
sur la régénération du nerf de grenouille comme le réel de hTERT (Dickson et al., 2000) dans l’espoir qu’un
phénodébut de la culture de tissus (Harrison, 1907). Incluant la type normal en résultera.
culture de fragments de tissus Schaeffer (Schaeffer, 1990), Malgré le très grand nombre d’articles montrant la
ele terme est devenu générique au cours du 20 siècle et a croissance cellulaire continue, in vitro, pendant la
preefni par englober la culture de tissus et d’organes. En tout mière moitié du 20 siècle, la culture de cellules L en 1943
cas en anglais. est considérée comme le premier exemple (Earle et al.,
La culture d’organe a en effet contribué notoirement 1943) et l’établissement de la première lignée continue
aux études développementales (Strangeways et Fell, 1925 ; humaine par la culture des cellules HeLa obtenue en 1952
Strangeways et Fell, 1926 ; Auerbach et Grobstein, 1958 ; (voir l’histoire de cette lignée dans la postface) (Gey et al.,
Cooper, 1965), à celles portant sur la différenciation (Fell 1952). Ce progrès permit le développement de nombreuses
et Robison, 1929) ou sur l’invasion maligne (Wolff, 1956 ; expériences in vitro, et posa son lot de problèmes dont
cerMareel et al., 1979), mais dans ces différentes études la tains n’ont pas encore trouvé de solution aujourd’hui.
culture de cellules impliquant l’isolement et la culture de On a proclamé possible la culture de lignées
cellucellules dispersées ou l’observation et la quantifcation sont laires épithéliales normales (Ebeling, 1924 ; Fischer, 1925)
préférentiellement visées, même si les cultures de tissus et de fbroblastes pendant 10 ans (Ebeling, 1922). Or,
ont généré la croissance de cellules qui pouvaient être pro- comme il a été montré plus tard, les fbroblastes ont une
pagées (Carrel et Burrows, 1910 ; Carrel, 1912). Initialement durée de vie limitée dans le temps (Hayfick et Moorhead,
l’attention se concentrait sur le tissu lui-même, et sa crois- 1961). Si les pionniers, un peu trop enthousiastes, ont droit
sance était utilisée comme un test de viabilité déterminé par à nos excuses, les chercheurs d’aujourd’hui ne peuvent
la génération de nouvelles cellules. Pour circonvenir l’argu- plus travailler avec des lignées non authentifées
(Capesment que ces cellules ne sont que le refet de migrations Davis et al., 2010). Il a été prouvé, en effet, que de
nomcellulaires hors de l’explant et non de la croissance, Rous et breuses lignées ont souffert de contaminations croisées
Jones (Rous et Jones, 1916) démontrèrent que des cultures ou ont été mal identifées… (Gartler, 1967 ; Nelson-Rees
pouvaient être réalisées à partir de cellules dispersées à et al., 1981) et pourtant certains chercheurs les utilisent
encore. Les cellules comme les Hep 2 et KB continuent à
* Traduit de l'anglais et adapté par Georgia Barlovatz-Meimon. être citées (environ 300 fois en 2011) de manière erronée
1Tableau 1-i évènements clés dans le développement de la culture de cellules et de tissus ( voir aussi Pollack R, 1981).
Date évènement référence
1907 Croissance de fbre nerveuse d’embryon de grenouille in vitro Harrison, 1907
1912 Explants de tissu conjonctif de poulet ; muscle cardiaque contractile Carrel et Burrows, 1910 ; Carrel, 1912
pendant 2-3 mois *
1916 Détachement par la trypsine et sous-culture d’explants Rous et Jones, 1916
1923 Sous-culture d’une lignée de cellules fbroblastiques * Carrel et Ebeling, 1923 ; Ebeling, 1924
1925, 26 Différenciation de tissus embryonnaires en culture d’organes Strangeways et Fell, 1925, 1926
1929 Culture d’organes d’os longs de poulet Fell et Robison, 1929
1941 Utilisation de trypsine en culture primaire de peau et de cœur * Medawar, 1941
1948 Introduction d’antibiotiques dans une culture de tissu * Keilova, 1948 ; Cruikshank et Lowbury,
1952
1943 Première lignée continue : fbroblastes de souris (L-cell) Earle et al, 1943
1948 Clonage des mêmes cellules Sanford et al, 1948
1949 Utilisation des cultures de cellules pour la croissance virale Enders et al, 1949
1952 Désagrégation de tissu embryonnaire à l’aide de trypsine * Moscona, 1952
Importance de la réagrégation de cellules dissociées pour la diffé- Moscona et Moscona, 1952
renciation *
Utilisation de trypsine pour la génération de sous-cultures Dulbecco, 1952
Virus plaque assay
Production de vaccin Salk contre la polio, dans des cellules de rein Kew et al., 2005
de singe
Première lignée humaine, HeLa, à partir d’un carcinome du col de Gey et al., 1952
l’utérus
1954 Découverte de l’inhibition de la mobilité par contact, dans des Abercrombie et Heaysman, 1953, 1954
cultures de fbroblastes
1955 Clonage cellulaire HeLa sur une couche nutritive homologue Puck et Marcus, 1955
Développement de milieux défnis qui néanmoins requièrent la pré - Eagle, 1955, 1959
sence de sérum Sanford et al., 1955 ; Harris, 1959
1958, 1959, Découverte de l’importance des infections par mycoplasmes (PPLO) * Coriell et al, 1958 ; Rothblat et Morton,
1960 1959 ; Nelson, 1960
1960 Transplantation nucléaire et détermination cellulaire Briggs et King, 1960 ; Gurdon, 1960
1961 Défnition de la durée de vie limitée des cellules humaines Hayfick et Moorhead, 1961
Fusion cellulaire et hybridation de cellules somatiques Sorieul et Ephrussi, 1961
1962 Établissement et transformation de la lignée BHK21 Macpherson et Stoker, 1962
Maintien des caractères différenciés de tumeurs pituitaires et des Buonassisi et al, 1962 ; Yasamura et al,
glandes surrénales 1966 ; Sato et Yasamura, 1966
Epidermal growth factor Cohen 1962
1963 Cellules 3T3 et transformation spontanée Todaro et Green, 1963
2 CULTURE DE CELLULES ANIMALESTableau 1-i (suite).
Date évènement référence
Induction de foie à partir d’endoderme sous l’action du mésen- Le Douarin, 1963
chyme cardiaque
1964 Pluripotence des cellules souches embryonnaires Kleinsmith et Pierce, 1964
Sélection de cellules transformées dans l’agar Macpherson et Montagnier, 1964
1964- 69 Vaccins rabique, antiourlien, antirubéoleux dans des fbroblastes de Wiktor et al, 1964 ; Sokol et al, 1968
poumon humain
1965 Clonage dans un milieu sans sérum de cellules de Hamster chinois Ham, 1965
Hétérokaryons – Homme/Souris Harris et Watkins, 1965
1966 Nerve growth factor Levi-Montalcini, 1966
Différenciation d’hépatomes de rat Tomkins et al, 1966
Formation de colonies par des cellules hématopoïétiques Bradley et Metcalf, 1966 ; Ichikawa et
al., 1966
Rôle de l’hydrocortisone et interaction cellulaire dans la différencia- Moscona et Piddington, 1966
tion de la rétine neurale *
1967 Epidermal growth factor in vitro Hoober et Cohen 1967
Contaminations croisées (HeLa) Gartler, 1967
Limitation de la prolifération par la densité cellulaire Stoker et Rubin, 1967
Établissement de lignées lymphoblastoïdes Moore et al, 1967 ; Gerper et al, 1969 ;
Miller et al, 1971
1968 Maintien de la différenciation dans des myoblastes normaux Yaffe, 1968
Prolifération indépendante de l’adhésion cellulaire Stoker et al, 1968
1969 Formation de colonies de cellules hématopoïétiques Bradley et Metcalf, 1966 ; Metcalf, 1969
1970 Développement de hottes à fux laminaire Kruse et al, 1991 ; Collins et Kennedy,
1999
1971 Culture d’épiderme de souris * Fusenig, 1971
1973 Transfert d’ADN Graham et Van der Eb, 1973
1974 Cellules neurosécrétrices clonées chez la souris * De Vitry et al, 1974
1975 Facteur(s) de croissance fbroblastique * Gospodarowicz, 1974 ; Gospodarowicz
et Moran, 1974
Anticorps monoclonaux Kohler et Milstein, 1975
1976 Totipotence des cellules souches embryonnaires Illmensee et Mintz, 1976
Milieux sans sérum supplémentés en facteurs de croissance Hayashi, I., Sato, G.H. 1976
1977 Confrmation de contamination de lignées tumorales par des Nelson-Rees et Flandermeyer, 1977
cellules HeLa
Détection de mycoplasmes par fuorescence de l’ADN * Chen, 1977
Couche nourricière de 3T3 et culture de peau Green, 1977
chApitre 1 ORIGINE DE LA CULTURE DE CELLULES 3Tableau 1-i (suite).
Date évènement référence
1978 Milieu MCDB sans sérum Ham et McKeehan, 1978
Interactions matricielles Gospodarowicz et al, 1978 ; Reid et
Rojkind, 1979
Morphologie cellulaire et contrôle de la croissance Folkman et Moscona, 1978
1980 Régulation de l’expression des gènes Darnell, 1982
Oncogènes, malignité et transformation Weinberg, 1989
1980 Matrice extracellulaire de cellules issues du sarcome de Engel- Hassell et al, 1980
TMbreth-Holm-Swarm (qui deviendra le Matrigel )
1981 Détection de nombreuses contaminations croisées de lignées cel- Nelson-Rees et al, 1981
lulaires
1983 Régulation du cycle cellulaire ; cyclines Evans et al, 1983 ; Nurse 1990
Immortalisation cellulaire par SV40 Huschtscha et Holliday, 1983
1980 Développement de milieux sélectifs pour lignées cellulaires spécia- Peehl et Ham, 1980 ; Hammond et al,
1987 lisées 1984 ; Knedler et Ham, 1987
1983 Culture de peau reconstituée Bell et al, 1983
1984 Production de tPA recombinant par des cellules mammifères Collen et al, 1984
1990 Culture à l’échelle industrielle de cellules transfectées, pour la pro- Butler, 1991
duction de produits pharmaceutiques
1991 Culture de cellules souches humaines mésenchymateuses Caplan, 1991
1998 Cartilage produit par ingénierie cellulaire Aigner et al, 1998
1998 Culture de cellules souches embryonnaires humaines Thomson et al, 1998
2000 Human genome project : génomique protéomique, défciences Dennis et al, 2001
génétiques et défauts d’expression
Réversion de mélanocytes en cellules gliales par l’endothéline 3 * Dupin et al, 2000
Réversion de progéniteurs oligodendrocytiques en cellules souches Kondo et Raff, 2000
neurales communes *
2002 Exploitation des méthodes d’ingénierie tissulaire Atala et Lanza, 2002 ;
Vunjak-Novakovic et Freshney, 2006
2003 Transition de cellules de Schwann en précurseurs de la glie et des Dupin et al, 2003
mélanocytes
2006 Reconnaissance des microvésicules (MV) comme un mode nouveau Ratajczak et al, 2006
de communication intercellulaire pendant la progression tumorale Lee et al 2011
2007 Reprogrammation de cellules adultes en cellules souches pluripo- Yu et al, 2007
tentes (iPS)
Codifcation à barre de la cytochrome oxydase I pour l’identifcation Cooper et al, 2007
des espèces
2008 Induction de cellules souches pluripotentes (iPS) par reprogramma- Huangfu et al, 2008
tion à l’aide d’acide valproïque
4 CULTURE DE CELLULES ANIMALESTableau 1-i (suite).
Date évènement référence
2010 L’ECACC a participé à la fondation du Comité d’authentifcation des Freshney, 2010
lignées cellulaires, l’ICLAC (International Cell Line Authentication Capes-Davis et al, 2010 ; Masters, 2012
Committee). L’ICLAC a pour objectif de permettre d’éviter la mau- Hanahan et Weinberg, 2011
vaise identifcation des lignées cellulaires en promouvant l’informa - De Rosa et al, 2012
tion sur ses conséquences scientifques *
2011 Weinberg revisite ses Hallmarks of cancer * Folkman et Moscona, 1978
2012 Description d’outils « intégrés » utilisables en culture cellulaire, de- Ingber et Folkman, 1989
puis les milieux de culture jusqu’aux réactifs ! * Wang et al, 1993, 2009
Kanapathipillai M, et al, 2012
Kuch et al, 2013
Biomécanique des cellules en culture : aboutissement d’un long ap- Mareel, 1992
prentissage des effets possibles des modifcations mécaniques de la Ratajczak et al, 2006
matrice extracellulaire sur le comportement des cellules en culture * Lee et al, 2011
La vision intégrative, et progressivement dynamique, du
microenvironnement cellulaire commence à remplacer celle des interactions
simplistes cellules/matrice extracellulaire. On progresse vers la
notion de « micro-écosystème » évoqué par M. Mareel depuis le début
des années 1990, en y adjoignant les nombreux rôles attribués aux
microvésicules *
Adapté de Freshney (2010), Culture of Animal Cells, New York, Wiley-Blackwell, Table 1.1. Reproduit avec autorisation de l’éditeur.
* Modifcations du texte original.
comme provenant d’un carcinome du larynx alors que La « pureté » des cultures dont on a cru qu’elle pouvait
ce sont en fait des cellules HeLa ! Le nombre total de lignées découler de l’utilisation d’échantillons de tissus « purs »
atteintes de contaminations croisées avoisine le nombre (Fischer, 1925) n’a pas pu être démontrée jusqu’à la mise
de 450 (http://standards.atcc.org/kwspub/home/the_ en œuvre de tests comme le clonage capillaire (Fischer,
international_cell_line_authentication_committee-iclac_/ 1925) avec lequel le clone L929 fut isolé de la lignée des
Cross_Contaminations) et le nombre de citations erronées cellules L. Puis fut développé le clonage par simple dilution
dépasse les 10 000. (Sanford et al., 1948), et aujourd’hui on utilise le clonage de
Ce problème n’appartenant pas seulement à l’histoire manière routinière pour purifer des populations cellulaires
de la culture cellulaire, il est indispensable de se plier à sous l’appellation plus précise de « clonage cellulaire »
l’authentifcation des lignées qu’on utilise (voir le site web (Puck et Marcus, 1955) par opposition au clonage de l’ADN
d’ICLAC : http://standards.atcc.org/kwspub/home/the_ ou au clonage d’animaux individuels.
international_cell_line_authentication_committee-iclac_). Enfn, le problème de la « transformation spontanée »
Un autre problème est celui des contaminations doit être évoqué (Fischer, 1925 ; Paul, 1975). Là également,
microbiennes favorisées par l’utilisation extensive des anti- des contaminations croisées étaient à l’origine de résultats
biotiques et des hottes à fux laminaire. erronés, publiés dans les premiers travaux notamment
Vint ensuite la découverte des mycoplasmes (Coriel ceux décrivant la « conversion de cellules épithéliales en
et al., 1958 ; Rothblat et Morton, 1959). Ces organismes, fbroblastes » où vraisemblablement les fbroblastes étaient
« présents dès le départ et dont le nombre a dépassé celui de Pleuropneumonia-like organisms » (PPLO) diffciles à
repérer même en contraste de phase, restent un facteur cellules épithéliales puisque leur croissance est plus rapide
(Todaro et Green, 1963 ; Nelson-Rees et al., 1981) (voir de modifcation des résultats obtenus à partir de cultures
contaminées. Leur identifcation puis leur éradication ne supra). Il est néanmoins diffcile de défnir la transformation
de cellules en culture puisque le mot est polysémique, mais sont pas aisées, malgré les tests simples à mettre en œuvre
comme le test d’ADN fuorescent (Chen, 1977) mais dont on peut citer certaines propriétés cellulaires « normales »
qui sont perdues lorsqu’il y a transformation (Abercrombie l’interprétation n’est pas évidente (Hearn et al., 1959). Cet
essai peut être confrmé par PCR (Uphoff et Drexler, 2013) et Heaysman, 1953). La reconnaissance cellulaire qui se
produit lorsque les cellules atteignent la confuence réduit, et grâce à un nombre considérable de « kits » commerciaux
(Freshney, 2010). dans un premier temps, la mobilité cellulaire ou inhibition
chApitre 1 ORIGINE DE LA CULTURE DE CELLULES 5de contact (Abercrombie et Heaysman, 1954 ; Macpherson Une seconde société, l’ESACT (European Society for
et Stoker, 1962) ce qui disparaît ensuite dans les cellules Animal Cell Technology, http://www.esact.org/) a été
transformées (Stoke et Rubin, 1967). La « topo-inhibition » créée en 1978 et a constitué un forum plus
biotechnolo1à haute densité cellulaire est également perdue chez les gique.
cellules transformées (Stoker et Rubin, 1967 ; Westermark,
1974 : Dulbecco et Elkington, 1973) et est accompagnée par
une capacité de croissance en suspension dans de l’agar référenCeS
mou (Macpherson et Montagnier, 1964).
Abercrombie M, Heaysman JE. (1953) Observations on the social La « dédifférenciation » ou la perte des
caractérisbehaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of tiques spécifques d’une cellule spécialisée peut également
chick heart fbroblasts in relation to their mutual contacts. Exp
survenir (Champy, 1913) mais il s’agit probablement d’un
Cell Res. 5:111-31.
artefact de culture. Néanmoins, l’apparition d’un phéno- Abercrombie M, Heaysman JEM. (1954) Observations on the
type indifférencié ou altéré peut survenir en culture en par- social behaviour of cells in tissue culture. II: “Monolayering” of
ticulier si les conditions environnementales correctes ne fbroblasts. Exp Cell Res. 6:293-306.
sont pas proposées aux cellules (Holtzer et al., 1960 ; Coon Aigner J, Tegeler J, Hutzler P, Campoccia D, Pavesio A, Hammer C,
et al. (1998) Cartilage tissue engineering with novel nonwoven et Cahn, 1966 ; De Vitry et al., 1974 ; Sato et Yasumura,
structured biomaterial based on hyaluronic acid benzyl ester. J 1966). Les milieux sélectifs sans sérum sont
particulièreBiomed Mater Res. 42(2):172-81.
ment utiles pour résoudre ce problème (Ham, 1963 ; Ham
Atala A, Lanza RP. (2002) Methods of Tissue Engineering. San
et McKeehan, 1978). Diego, Academic Press.
La recherche de tels milieux a commencé dans les Auerbach R, Grobstein C. (1958) Inductive interaction of
embryoannées 1940, le plus populaire étant le milieu BME ou MEM nic tissues after dissociation and reaggregation. Exp Cell Res.
15:384-97.d’Eagle (Eagle, 1955 ; Eagle, 1959) ; ils ont graduellement
Bell E, Sher S, Hull B, Merrill C, Rosen S, Chamson A, et al. (1983) remplacé les milieux « naturels » utilisés jusque-là,
l’obThe reconstitution of living skin. J Invest Dermatol. 81(1 jectif fnal étant de remplacer totalement le sérum. C’est
Suppl):2s-10s.
dans le laboratoire de Ham, dans le Colorado, que furent
Bradley TR, Metcalf D. The growth of mouse bone marrow cells in
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Butler M. (1991) Mammalian cell biotechnology. Oxford, IRL Press
majeures de l’expansion des cultures de cellules et l’une
at Oxford University Press.
de ses applications majeures qui vont de la contribution à Capes-Davis A, Theodosopoulos G, Atkin I, Drexler HG, Kohara
la génétique des cellules somatiques (Sorieul et Ephrussi, A, Macleod RA, et al. (2010) Check your cultures! A list of
1961 ; Harris et Watkins, 1965) et les techniques de trans- cross-contaminated or misidentifed cell lines. Int J Cancer.
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chApitre 1 ORIGINE DE LA CULTURE DE CELLULES 9Par Tie i
Biologie et environnement
des cellules en cultureadhésion cellulaire 2A. PIERRES, P. BoNGRAND
en cellules adipeuses (Park et al., 2009). Comme cela est introduction
indiqué plus loin (voir page 26, Comment l’adhésion à un
substrat peut-elle modifer le comportement cellulaire ?),
Les interactions adhésives régulent le comportement cellulaire est déterminé en partie
seulela quasi-totalité des fonctions cellulaires ment par la nature des récepteurs membranaires qui ont
été stimulés.L’adhésion d’une cellule à une autre cellule ou à une
surface est un processus fondamental qui infuence pro -
Migration
fondément son comportement. Cette affrmation peut être
Le développement des organismes multicellulaires illustrée par quelques exemples représentatifs.
nécessite que leurs constituants s’organisent au moyen de
Survie et prolifération déplacements appropriés (Kardash et al., 2009). Au cours
d’étapes plus tardives de leur maturation, la capacité migra-La capacité de se maintenir en état de fonctionner et
toire est également indispensable au fonctionnement de de se multiplier est évidemment la propriété fondamentale
certaines populations telles que les cellules immunitaires.des cellules vivantes. On sait depuis longtemps que la
pluIl existe plusieurs mécanismes permettant à des cel-part des cellules ont besoin d’adhérer à un substrat pour
lules de se déplacer : le déplacement sur une surface est survivre : c’est la dépendance vis-à-vis de l’attachement
peut-être le modèle qui a été le plus étudié. Ce mouve-(anchorage dependence) dont la perte constitue un des
ment est typiquement constitué d’un cycle comportant facteurs de la transformation tumorale. On appelle anoikis
l’émission vers l’avant d’un lamellipode qui va adhérer au la mort cellulaire causée par un défaut d’attachement aux
substrat, et permettre l’avancement de la cellule à la suite surfaces environnantes. Une exception notable est
constid’une contraction suivie du détachement (déadhésion) de tuée par les cellules immunitaires qui peuvent survivre et
la région située à l’arrière (uropode). La capacité de dépla-exercer leurs fonctions en suspension, en particulier dans
cement dépend qualitativement et quantitativement du le sang ou dans la lymphe.
contrôle de l’adhésion (Palecek et al. 1997) : un défcit de Les mécanismes mis en jeu restent incomplètement
l’adhésion cellulaire, causé par exemple par une anomalie compris et seront discutés brièvement dans la dernière
parde l’expression des intégrines, peut entraîner des anoma-tie de ce chapitre. On sait que des récepteurs cellulaires tels
lies de la migration. Une adhésivité excessive peut compro-que les intégrines ont la capacité d’engendrer des cascades
mettre la migration si la cellule ne peut détacher facilement de signalisation (Zhao et al., 2009) qui favorisent la survie
l’uropode (Fehr et Dahinden, 1979 ; Palecek et al. 1997).cellulaire lorsqu’ils ont fxé leur ligand (on parle de signa -
Il faut cependant rappeler que la migration cellu-lisation centripète, ou outside-in). Cependant, des
phénolaire peut également faire appel à des mécanismes indé-mènes biophysiques sont également mis en jeu, et la survie
pendants de l’adhésion, lorsque le déplacement s’effectue cellulaire semble due en partie à la déformation induite par
dans un environnement tridimensionnel (Lammermann et les interactions adhésives (Folkmann et Moscona, 1978 ;
al., 2008).Chen et al., 1997).
Activation de fonctions spécifquesDifférenciation
Alors que la différenciation cellulaire est un proces-La différenciation cellulaire est un processus
fondamental qui peut être fortement infuencé par des interac - sus relativement lent qui peut nécessiter plusieurs heures à
tions adhésives. Par exemple, l’adhésion des monocytes à plusieurs semaines, l’adhésion infuence largement la réac -
tivité cellulaire et le déclenchement de fonctions rapides et une surface appropriée peut suffre à déterminer leur diffé -
renciation en macrophages (Kaplan et al., 1982). L’adhésion préprogrammées telles que la sécrétion de médiateurs. Par
de cellules souches à des surfaces exposant des ligands de exemple, l’adhésion de granulocytes sanguins à de
nomcertaines intégrines b1 peut entraîner la différenciation breux substrats peut diminuer leur capacité de libérer des
13dérivés réactifs de l’oxygène en réponse à des facteurs de topographie
stimulation appropriés (Laurent et al., 1991). Au contraire, Récemment, de nombreux travaux ont démontré de
la réactivité des lymphocytes T vis-à-vis des antigènes est manière spectaculaire la sensibilité des cellules adhérentes
augmentée par des interactions adhésives avec les cellules à la topographie des surfaces sous-jacentes.
présentatrices (Contento et al., 2010). Comme nous l’avons En ce qui concerne la topographie tridimensionnelle,
indiqué plus haut, l’engagement de certains récepteurs une rugosité minimale favorise l’adhésion de phagocytes
membranaires n’explique pas à lui seul les modifcations mononucléés (Rich et al., 1981 ; Geblinger et al., 2010) ou
du comportement cellulaire (Pierres et al., 2002). de fbroblastes (Ranella et al., 2010) à des surfaces. Lorsque
des surfaces de plastique ont été rendues rugueuses par
grattage mécanique, elles ont acquis la propriété de sti-Le comportement des cellules adhérentes
muler une réponse oxydative chez les granulocytes neutro-dépend très signifcativement des
philes (Chang et al., 2003).
propriétés physiques du substrat D’autres expressions ont montré que les cellules
pouvaient détecter des propriétés nanométriques des surfaces : La plupart des expériences décrites dans la
littérala présence d’îlots d’une hauteur de 13 nm a suff à modifer ture scientifque suggèrent que le comportement cellulaire
profondément le transcriptome de fbroblastes déposés sur est essentiellement dicté par l’interaction de ligands
spéces surfaces (Dalby et al., 2002). Il est intéressant de remar-cifques avec des récepteurs membranaires, tels que les
quer que les cellules sont sensibles à l’ordre et à la symé-intégrines qui sont des récepteurs d’adhésion, mais aussi
trie des surfaces sous-jacentes : l’introduction de puits d’un des récepteurs de substances solubles telles que des
hordiamètre de quelques dizaines de nm sur des surfaces de mones. Cependant, un nombre croissant d’expériences
polyméthylméthacrylate a diminué leur capacité d’adhérer montre que les propriétés physicochimiques des surfaces
à des cellules de mammifères, et cette diminution était plus
infuencent également de manière très signifcative le com -
importante lorsque ces éléments étaient ordonnés géomé-portement des cellules adhérentes. Nous allons citer
rapitriquement (Curtis et al., 2004).
dement les paramètres dont l’importance est démontrée.
La répartition bidimensionelle des motifs molécu-L’interprétation des quelques exemples que nous allons
laires est également importante : on a montré que des
citer suscite actuellement de nombreux travaux.
cellules fbroblastoïdes murines migraient plus effcace -
ment sur des surfaces exposant des ligands de certaines Hydrophobie, polarité, énergie de surface
intégrines (groupement RGDS) lorsque ces ligands étaient
Après la mise au point de la théorie DLVO (Derjaguin- regroupés en microagrégats plutôt que d’être répartis de
Landau-Verwey-Overbeek), de nombreux auteurs ont manière homogène, à la même densité (Maheshwari et al.,
cherché des relations entre les interactions cellule-cellule 2000). Plus récemment, on a montré que des fbroblastes
et cellule-surface et les paramètres structuraux liés à l’éner- de rat s’étalaient moins bien sur des surfaces exposant des
gie de surface (Curtis, 1967). Certains résultats semblent ligands des intégrines lorsque l’espacement de ces ligands
de portée assez générale. Ainsi, les cellules phagocytaires passait de 58 à 108 nm (Cavalcanti-Adam et al., 2007).
disposent de mécanismes leur permettant de fxer et éven -
tuellement de capter des structures hydrophobes (van rigidité
Oss et al., 1975 ; Capo et al., 1979 ; Rich et al., 1981). De Au cours de la dernière décennie, un nombre
croismême, une réduction de la charge superfcielle négative sant de travaux ont montré que le comportement de très
portée par la plupart des cellules facilite généralement les nombreuses populations cellulaires dépendait des
prointeractions adhésives (Mège et al., 1987). Cependant, il priétés mécaniques du milieu environnant. Le résultat le
paraît très diffcile de déduire des prédictions utiles de ces plus connu est sans doute la constatation que des cellules
données générales (Vitte et al., 2004). Ces diffcultés sont souches mésenchymateuses déposées sur des surfaces de
dues en partie à la raison suivante : une surface introduite collagène se différenciaient respectivement en neurones,
dans un milieu biologique se trouve quasi-immédiate- en cellules musculaires ou en ostéoblastes suivant que le
ment recouverte d’une couche de protéines adsorbées. La module d’Young du support du collagène était très faible
nature des protéines adsorbées n’est pas stable au cours (0,1-1 kPa), intermédiaire (8-17 kPa) ou élevé (25-40 kPa)
du temps et se trouve très diffcile à prévoir. D’autre part, (Engler et al., 2006). D’autres auteurs ont montré que
l’étala conformation des protéines qui sont adsorbées est pro- lement de macrophages alvéolaires (Féréol et al., 2006) ou
gressivement modifée d’une manière dépendante des de cellules myogéniques murines (Ladoux et al., 2010) était
propriétés physico chimiques de la surface, et ces modifca - facilité lorsque la rigidité du substrat sous-jacent était
augtions peuvent conduire à exposer des séquences protéiques mentée. Enfn, l’étude de la migration de cellules NIH-3T3
reconnues spécifquement par des récepteurs cellulaires. Il sur des substrats hétérogènes présentant des régions de
est donc très diffcile de déterminer et de prévoir la contri - rigidité variable a montré que les cellules se déplaçaient de
bution propre aux interactions « non spécifques » que préférence vers les régions les plus rigides. Ce phénomène
nous venons de mentionner (Vitte et al., 2004). a été nommé durotaxie (Lo et al., 2000).
14 PARTIE I BIOLOGIE ET ENVIRONNEMENT DES CELLULES EN CULTURE en conclusion, il est maintenant bien établi que les identifées. Il y a une dizaine d’année, un auteur d’une com -
cellules adhérant à un substrat perçoivent à la fois la struc- pilation des antigènes spécifques leucocytaires (Barclay
ture biochimique et les propriétés physiques de ce substrat. et al., 1997) estimait que 25 à 50 % des antigènes «
spéLes mécanismes mis en jeu, en particulier les mécanismes cifques » des leucocytes pouvaient être impliqués dans
de mécanotransduction, restent actuellement incomplète- l’adhésion cellulaire (Barclay, 1998). Il est donc tentant de
ment compris et font l’objet de recherches très actives. rattacher le comportement adhésif de chaque cellule à
l’ensemble des récepteurs d’adhésion exprimés à sa surface. Il
serait utile, mais diffcilement réalisable, de connaître avec L’adhésion cellulaire repose
précision les caractéristiques fonctionnelles de tous les
essentiellement sur de très nombreux récepteurs d’adhésion. Il nous a donc semblé justifé d’in -
récepteurs membranaires spécialisés clure dans ce chapitre une description extrêmement
simplifée des principales familles de molécules d’adhésion, Il est largement admis que les interactions adhésives
dans le but de fournir au lecteur quelques idées générales sont essentiellement déterminées par des interactions
qui devraient faciliter l’analyse de la masse considérable de moléculaires spécifques établies entre des récepteurs
données expérimentales qui se rapportent à l’adhésion.membranaires et leurs ligands (fgure 2-1 ). Ce point peut
Le choix des exemples retenus refète le domaine d’in -être considéré comme assez clairement établi, même si
térêt des auteurs de ce chapitre. des interactions non spécifques mentionnées plus haut
peuvent largement infuencer l’adhésion cellulaire (Vitte
Sélectines
et al., 2004), et si les interactions spécifques et non spé -
cifques font appel aux mêmes mécanismes moléculaires On connaît trois espèces de sélectines
respectivement exprimées par les cellules endothéliales (E-sélectine fondamentaux, ce qui peut rendre leur distinction
partiellement arbitraire (Bongrand, 1998). ou CD62E), les cellules endothéliales et les plaquettes
La multiplicité des interactions adhésives subies par (P-sélectine ou CD62P), et les leucocytes (L-sélectine ou
CD62L). La région extracellulaire des sélectines est consti-les cellules vivantes est bien refétée par la multiplicité des
récepteurs d’adhésion exprimés sur les membranes cel- tuée d’un nombre variable (2 à 9) de domaines
répétilulaires. Des centaines de molécules d’adhésion ont été tifs (domaines CCP : complement control protein), d’un
figure 2-1 exemples de récepteurs d’adhésion. Les domaines extracellulaires des molécules sont schématisés en conservant
une échelle approximative. Les parties intracellulaires et les interactions avec les molécules cytoplasmiques ne sont pas représentées.
On voit que les dimensions de ces molécules varient considérablement : la longueur du couple P-sélectine/PSGL-1 atteint presque
0,1 mm, la dimension du couple TCR (récepteur des lymphocytes T)/MHC I (molécule d’histocompatibilité de classe I) est 5 à
6 fois plus faible. On a représenté PSGL-1 comme un dimère, mais de nombreux récepteurs d’adhésion sont dimérisés (c’est le cas
de ICAM-1) ou oligomérisés (c’est le cas des intégrines activées) à la surface des cellules. Les cadhérines sont aussi largement
regroupées. La leucosialine est une molécule de grande taille dont on a estimé qu’elle pouvait recouvrir 10 % de la surface
des lymphocytes. On peut dont aisément imaginer qu’elle entrave les interactions des récepteurs d’adhésion, particulièrement
de ceux dont les dimensions sont les plus réduites.
chApitre 2 ADHÉSION CELLULAIRE 15domaine EGF-like et d’un domaine distal, NH-2 terminal, points seront détaillés plus loin (voir page 25, Contrôle du
qui est une lectine animale de type C interagissant avec le détachement des cellules adhérentes).
motif sialyl-Lewis X. On classe volontiers les intégrines en fonction de leur
La fonction principale des sélectines consiste à initier chaîne b . Nous citerons seulement quelques exemples :
l’interaction des leucocytes ou des plaquettes et des parois — les intégrines portant une chaîne b1 (CD29)
des vaisseaux sanguins en présence de forces hydrodyna- sont ubiquitaires et reconnaissent souvent des
constimiques importantes. Par exemple, lorsque la stimulation tuants des matrices extracellulaires tels que le collagène
de cellules endothéliales entraîne l’expression membra- (intégrines α1b1 ou CD49aCD29, α2b1 ou CD49bCD29), la
naire de P-sélectine, il en résulte un « accrochage » des laminine (α3b1) ou la fbronectine ( α5b1). Ces intégrines
leucocytes circulants dont la vitesse est considérablement sont parfois nommées VLA-1, 2... (Very Late Antigen 1, 2...),
réduite (typiquement d’un facteur 100, de quelques mm/s parce qu’elles sont exprimées tardivement sur des
lymphoà quelques dizaines de mm/s). Ils adoptent un mouvement cytes T maintenus en culture prolongée. Le motif RGD
(Argsaccadé appelé roulement (rolling), attribué à la formation Gly-Asp) est reconnu par de nombreuses intégrines (telles
et à la dissociation rapide de liaisons transitoires entre les que α5b1), et cette propriété a souvent été utilisée pour
sélectines et leurs ligands. Ce mouvement a été reproduit recouvrir des surfaces artifcielles de ligands synthétiques
avec des cellules fxées, ce qui suggère qu’il repose sur des des intégrines. Cependant, les interactions physiologiques
mécanismes purement physiques (Von Andrian et al., 1991, sont plus complexes : par exemple, l’intégrine α5b1
reconLawrence et Springer, 1993). Le rôle des sélectines n’est naît sur la fbronectine un site « RGD » et un site qualifé de
cependant pas uniquement mécanique et celles-ci peuvent synergique. Notons que l’intégrine α4b1 interagit avec deux
transmettre des informations aux cellules qui les expriment ligands importants : la fbronectine, mais aussi la molécule
(Kaplanski et al., 1994). VCAM-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule 1, CD106) qui
peut être exprimée par des cellules endothéliales
convenaMucines blement activées ;
Ce terme désigne des protéines dont la forte glycosy- — les intégrines portant une chaîne b2 (CD18)
lation empêche leur repliement et leur confère une forme sont les intégrines leucocytaires. On en connaît quatre
allongée. Du fait de leur encombrement et d’une charge types. Celle qui a été identifée la première est LFA-1
négative due aux résidus d’acide sialique, elles peuvent (CD11aCD18, Lymphocyte Function Associated 1). Elle
exercer une action anti-adhésive qui sera discutée plus fxe essentiellement des molécules ICAM ( Intercellular Cell
loin (voir page 25, Contrôle du détachement des cellules Adhesion Molecule) qui sont ubiquitaires (on en connaît
adhérentes). Au contraire, ces molécules peuvent induire cinq types, ICAM-1 à ICAM-5). La molécule LFA-1 joue un
de manière très effcace une adhésion avec des cellules rôle essentiel dans le fonctionnement du système
immuniexprimant des lectines, et en particulier des sélectines. On taire, en participant aux déplacements des cellules
immupeut ainsi citer la molécule CD34 exprimée par certaines nitaires dans l’organisme, aux interactions leucocytaires,
cellules endothéliales, qui est un ligand de la L-sélectine. et à des fonctions effectrices telles que la cytotoxicité à
La molécule MAdCAM-1 (Mucosal Adressin Cell Adhesion médiation lymphocytaire. L’intégrine CD11bCD18 (Mac-1,
Molecule 1) est exprimée par certaines cellules endothé- CRIII) reconnaît non seulement ICAM-1 mais aussi un
proliales, et sa région extracellulaire comporte un segment duit de réaction du complément (le C3bi) et de très
nommucinique qui interagit avec la L-sélectine. La molécule breux ligands, qui incluent le fbrinogène et la fbronectine
PSGL-1 (P-Selectin Glycoprotein Ligand 1, CD162) est le (Yakubenko et al., 2002) ;
principal récepteur leucocytaire de la P-sélectine. — parmi les intégrines portant une chaîne b3
(CD61) on peut citer l’intégrine plaquettaire α2bb3
intégrines
(CD41CD61) qui joue un rôle important dans la
coagulaLes intégrines sont les principaux récepteurs permet- tion sanguine, et le récepteur de la vitronectine αVb3.
tant aux cellules des métazoaires de se fxer aux matrices
Membres de la superfamille des immunoglobulinesextracellulaires (Hynes, 2002). Ce sont des
hétérodimères αb. On connaît 18 espèces de chaînes α, 8 espèces Ces molécules sont défnies par la présence d’un
de chaînes b, et 24 intégrines ont été décrites. nombre variable de domaines initialement identifés sur
Les intégrines ont été qualifées de « machines bidi - les molécules d’immunoglobulines (Williams et Barclay,
1988). Ces domaines constitués d’environ 110 acides ami-rectionnelles » (Hynes, 2002, Abram et al., 2009) : la fxa -
tion d’un ligand entraîne le déclenchement d’une cascade nés ont des propriétés structurales remarquables : deux
feuillets b anti-parallèles comportent 7 brins b. Un pont de signalisation intracellulaire (signalisation centripète, ou
outside-in). Réciproquement, l’activité fonctionnelle des disulfure forme une boucle d’une soixantaine d’acides
aminés. Les dimensions typiques d’un domaine de ce type sont intégrines est contrôlée par de signaux centrifuges
(insideout) qui peuvent modifer leur conformation, leur répar - 4 nm × 2,5 nm × 2,5 nm. Ce domaine se retrouve sur de
tition topographique sur la membrane plasmique et leur très nombreuses molécules dont le domaine d’expression
interaction avec le cytosquelette sous-membranaire. Ces dépasse largement le système immunitaire. On peut citer
16 PARTIE I BIOLOGIE ET ENVIRONNEMENT DES CELLULES EN CULTURE les produits du complexe majeur d’histocompatibilité, des détaillerons successivement l’étude des propriétés
mécarécepteurs des cellules immunitaires (récepteurs de l’anti- niques et morphologiques de l’adhésion.
gène des lymphocytes T et B, récepteurs du fragment Fc
des immunoglobulines retrouvés sur les lymphocytes et les
Propriétés mécaniques et/ou cinétiques
cellules phagocytaires) et de nombreuses molécules
d’adde l’adhésionhésion (CAM : Cell Adhesion Molecules) parmi lesquelles
on peut citer : La première étape de l’étude d’un phénomène doit
— ICAM-1 (Intercellular Cell Adhesion Molecule 1, consister à le défnir. On peut défnir l’adhésion d’une
CD54), ubiquitaire et en particulier largement exprimée par cellule à une surface comme la propriété de cette cellule
les cellules endothéliales, qui peuvent ainsi interagir avec de rester au contact de la surface en présence d’une force
les intégrines leucocytaires LFA-1 et Mac-1 ; séparatrice F appliquée pendant une période de temps de
— VCAM-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule 1, durée t. Parmi les nombreuses méthodes qui ont été
utiCD106), dont l’expression sur les cellules endothéliales lisées pour appliquer à des cellules des forces contrôlées
activées permet de fxer l’intégrine VLA-4 exprimée par (Bongrand et al., 1982 & 1994), celles qui utilisent les
écoucertaines populations leucocytaires ; lements hydrodynamiques sont peut-être les plus sensibles
— PECAM-1 (Platelet Endothelium Cell Adhesion et les plus versatiles et nous insisterons essentiellement sur
molecule 1, CD31), exprimée par les cellules endothéliales celles-ci. D’autres méthodes, faisant appel à la
centrifugaet les leucocytes. C’est une molécule d’adhésion homoty- tion, à l’utilisation de micropipettes ou à la microscopie à
pique qui semble impliquée dans la migration des leuco- force atomique seront mentionnées plus brièvement.
cytes sanguins entre les cellules endothéliales ;
— JAM-1 (Junctional Adhesion Molecule, JAM-1), Étude de l’adhésion au moyen d’écoulements
également une molécule d’adhésion homotypique expri- hydrodynamiques
mée par les cellules endothéliales et les cellules
immuniLes chambres à fux laminaire constituent certaine -
taires. Elle interagit également avec LFA-1 ;
ment l’outil le plus utilisé (Pierres et al., 2008). Le
prin— NCAM (Neural Cell Adhesion Molecule),
égalecipe général est rappelé sur la fgure 2-2 : si un fuide
ment une molécule d’adhésion homotypique impliquée
incompressible et visqueux tel que l’eau s’écoule au
voidans les interactions des cellules nerveuses.
sinage d’une surface plane solide, la vitesse du fuide
est considérée comme nulle au contact de la surface. En en conclusion : les interactions adhésives
surpremière approximation, si l’écoulement satisfait à
cerviennent de manière ubiquitaire au cours de la vie de la
taines conditions de régularité, la vitesse du fuide à une majorité des espèces cellulaires, et guident la plupart des
distance z très faible de la surface est égale au produit de décisions et des comportements de ces cellules. L’adhésion
z par le taux de cisaillement G (shear rate) qui caractérise d’une cellule à une surface est essentiellement
détermi–1l’écoulement et s’exprime en s . Une cellule considérée née par les sites de reconnaissance exposés par les deux
comme une sphère de rayon a située au « contact » de surfaces en présence. Cependant, l’adhésion et ses
conséla paroi est entraînée avec une vitesse de l’ordre du pro-quences dépendent également de manière importante de
duit G × a. Par exemple, une cellule d’un rayon de 5 mm propriétés physicochimiques et physiques des surfaces :
–1soumise à un taux de cisaillement de 5 s se déplacera à hydrophobie ou polarité, rigidité, topographie
tridimenune vitesse de l’ordre de 25 mm/s et son déplacement sera sionnelle ou dans le plan de la surface.
facile à observer au microscope. Si la cellule adhère à la Avant de discuter les mécanismes de régulation et les
surface et reste immobile, la force hydrodynamique d’en-conséquences de l’adhésion, nous décrirons rapidement
2traînement est voisine de 32 h a G, où h est la viscosité du quelques méthodes de mesure qui nous semblent
particufuide (la viscosité de l’eau à la température du laboratoire lièrement utiles. Des détails supplémentaires peuvent être
ou à 37 °C est de l’ordre de 0,001 Pascal seconde). Dans trouvés dans des ouvrages spécifques (Curtis et Lackie,
l’exemple que nous avons cité, la force exercée sur une 1991 ; Bongrand et al., 1994).
–12cellule à l’arrêt est donc voisine de 4 × 10 newton soit
4 piconewtons (pN). D’autre part, si la position du centre
de la cellule est déterminée avec une précision de l’ordre
Méthodes d’étude de l’adhésion de 0,2 mm, l’instant de l’arrêt peut être déterminé avec une
précision de l’ordre de 100 millisecondes (des techniques cellulaire : aspects généraux
très simples de traitement d’image permettent
d’augmenIl ne serait pas justifé de passer en revue toutes les ter considérablement cette précision). Cet exemple illustre
techniques qui ont pu être utilisées pour étudier l’adhé- la sensibilité et la résolution temporelle de la chambre à
sion cellulaire. Nous présenterons seulement quelques fux laminaire qui permet de détecter l’adhésion induite
par un seul récepteur membranaire (Kaplanski et al., 1993 ; méthodes qui ont permis d’obtenir des indications
essentielles sur la nature et les mécanismes de l’adhésion. Nous Pierres et al., 2008).
chApitre 2 ADHÉSION CELLULAIRE 17figure 2-2 La chambre à fux laminaire. Des cellules ou des microsphères (disques verts) couverts de récepteurs (en bleu) sont
entraînées dans une chambre à faces parallèles dont le plancher est couvert de ligands (en rouge). Au voisinage de ce plancher,
la vitesse d’écoulement du fuide est approximativement égale au produit de la distance à la paroi (z) par le taux de cisaillement,
–1ou gradient de vitesse (G) exprimé en s . La vitesse des microsphères au voisinage de la paroi est légèrement inférieure au produit
–1de leur rayon (a) par le taux de cisaillement. Lorsque G est de l’ordre de quelques s , les particules micrométriques se déplacent
à une vitesse de l’ordre de 10 mm/s. Une seule liaison ligand/récepteur sufft à les arrêter, car la force hydrodynamique qui les
entraîne est de l’ordre du pN, et la force exercée sur une liaison maintenant une particule à l’arrêt (fèche rouge) est de l’ordre
de quelques pN. La chambre à fux laminaire permet donc de visualiser la formation et la dissociation de liaisons moléculaires
individuelles soumises à des forces contrôlées.
Les expériences initialement réalisées ont permis Kukan, 1984 ; Evans et Yeung, 1989) : le principe consiste à
d’obtenir les ordres de grandeur suivants (Mège et al., aspirer une cellule avec une pression de l’ordre de quelques
1986). Une liaison ligand-récepteur permet à une cellule de dizaines à quelques centaines de Pascals (soit quelques
résister à une force de détachement de quelques dizaines mm à quelques cm d’eau) dans une micropipette dont le
à quelques centaines de pN. L’attachement se consolide diamètre d’ouverture est de l’ordre du mm (fgure 2-3 ). La
progressivement et, après quelques minutes à quelques force totale d’aspiration peut donc être estimée de quelques
dizaines de minutes l’adhésion peut résister à une force dizaines à quelques centaines de pN. L’aspiration entraîne
de détachement de quelques nanonewtons à quelques la formation d’une protrusion qui pénètre dans la
micropidizaines de nanonewtons. Le détachement peut s’accom- pette. La dynamique du mouvement permet d’obtenir des
pagner d’une déformation cellulaire progressive. On peut informations quantitatives sur les propriétés mécaniques
donc penser que la rigidité membranaire contribue à la de la cellule. L’utilisation de deux micropipettes permet
solidité de l’attachement (Rees et al., 1977). ensuite de réaliser un contact entre deux cellules qui sont
Plus récemment, l’utilisation de méthodes d’analyse ensuite progressivement séparées. L’étude des
déformaassistée par ordinateur a permis d’obtenir des
renseignetions associées au détachement permet d’obtenir des
ments plus précis en suivant les trajectoires des cellules
indications très sensibles concernant la force de
détacheindividuelles. Les liaisons initiales formées par des
récepment. Dans une étude pionnière réalisée sur l’agglutination
teurs d’adhésion tels que les intégrines ont une durée
des hématies par des lectines, Evans et Yeung (1991) ont
de vie courte, de l’ordre de la seconde, qui dépend de la
montré que la force nécessaire pour séparer des hématies
conformation de la molécule (Masson-Gadais et al., 1999).
liées par des concentrations très faibles de lectine était de
L’attachement initial peut être consolidé en plusieurs
l’ordre d’une dizaine de pN, ce qui correspondait vraisem-dizaines de secondes, ce qui met en jeu des mécanismes
blablement à des interactions moléculaires individuelles. de régulation complexes qui peuvent être altérés chez des
Malgré leur très grande sensibilité, les méthodes reposant sujets présentant des anomalies génétiques de certaines
sur l’étude des micropipettes comportent une résolution protéines associées aux intégrines (Robert et al., 2011).
temporelle limitée. D’autre part, leur mise en œuvre est
Étude de l’adhésion au moyen de micropipettes lente et complexe : l’observation d’une dizaine de cellules
nécessite couramment une demi-journée, voire une jour-Les micropipettes ont constitué un outil très puissant
d’étude des propriétés mécaniques des cellules (Evans et née complète de manipulation.
18 PARTIE I BIOLOGIE ET ENVIRONNEMENT DES CELLULES EN CULTURE force constante. Le mode « force » consiste à approcher Microscopie à force atomique
et éloigner la pointe de la surface sans balayage latéral,
On sait que le principe général de la microscopie à en enregistrant les variations de la force et de la distance
force atomique consiste à balayer une surface au moyen (fgure 2-4 ). Cet outil a permis d’étudier la formation et la
d’une pointe de dimensions nanométriques fxée à un dissociation de liaisons individuelles entre récepteurs et
ressort plat (cantilever) de très faible raideur (typique- leurs ligands (Florin et al., 1994). On a pu également
l’appliment quelques dizaines de pN par nm) en maintenant une quer à l’étude de l’adhésion cellulaire en fxant des cellules
figure 2-3 aspiration d’une cellule dans une micropipette. La technique d’aspiration dans une micropipette a été très utilisée
pour étudier les propriétés mécaniques des cellules : le principe (a) consiste à étirer une micropipette dont le rayon interne
à l’extrémité (R ) est de l’ordre d’un à quelques mm. On peut facilement fxer la pression d’aspiration (p3 – p1) au moyen d’un tube p
en U : des valeurs de l’ordre d’un mm à 1 cm d’eau (soit une dizaine à une centaine de Pa) sont facilement obtenues. Une cellule
aspirée à l’entrée de la pipette forme une protrusion dont la longueur L croît progressivement, entraînant une augmentation de l’aire
apparente de la cellule dont on admet qu’elle se déforme à volume constant. La mesure de la relation entre L, la pression d’aspiration
et les dimensions de la pipette et de la cellule permet de construire un modèle mécanique de la cellule, en s’appuyant sur un modèle
approprié. Un exemple de cellule (cellule de la lignée monocytaire humaine THP-1) soumise à une aspiration est montré à droite (B).
figure 2-4 Mesure des interactions ligand-récepteur à l’échelle de la liaison individuelle avec un microscope à force atomique.
(a) Une pointe (triangle jaune) recouverte de récepteurs est montée sur un ressort plat (cantilever C) et approchée d’un échantillon
(E) porteur de molécules de ligand. Un quartz piézoélectrique permet de déplacer verticalement l’échantillon avec une précision
subnanométrique. Le rayon d’un laser (L) est réféchi par un miroir monté sur le cantilever (M) et sa défection est mesurée
au moyen d’une diode à quadrant (D). La force appliquée sur la pointe peut donc être contrôlée en temps réel. (B) Schéma d’une
mesure typique en mode force. La courbe représente l’évolution de la force (F) ressentie par la pointe en fonction de la hauteur (d)
de l’échantillon : après une première phase d’approche (1 : force nulle), la force croît proportionnellement à d quand l’échantillon
a rencontré la pointe. On redescend ensuite l’échantillon (3) : si une liaison s’est formée, une force de traction apparaît et s’annule
brusquement (5) : la force mesurée à ce moment est appelée « force de rupture » (unbinding force).
chApitre 2 ADHÉSION CELLULAIRE 19individuelles sur des cantilevers. Les cellules sont ensuite comptées. Cette méthode a permis de mettre en évidence
appuyées contre des surfaces (typiquement, on peut utili- une consolidation progressive de l’adhésion de cellules
ser un temps de contact de l’ordre de la seconde et une embryonnaires de rétine de poulet. Ce processus
s’effecforce de l’ordre de la centaine de pN (Puech et al., 2005 ; tuait en une dizaine de minutes et n’était pas retrouvé en
Franz et Puech, 2008). La cellule est alors soumise à une présence d’inhibiteurs métaboliques.
force de rétraction augmentant linéairement avec le temps. •  La méthode des « trappes optiques » ou « pinces
La force appliquée au moment du détachement est appe- optiques » consiste à utiliser la propriété du faisceau d’un
lée force de rupture ou de détachement (unbinding force). laser focalisé sur un champ microscopique de retenir des
Il a ainsi été possible de mesurer des forces de rupture de microsphères au point de focalisation. Il est ainsi possible
quelques nanonewtons qui augmentaient progressivement de déplacer les microsphères sous observation
microsdurant les quelques dizaines de secondes suivant l’établis- copique en utilisant des forces de l’ordre de quelques
sement du contact (Krieg et al., 2008). piconewtons, ce qui permet de mesurer des forces
d’interaction cellule-surface avec une très grande sensibilité.
Sonde montée sur vésicule (« Biomembrane Force
Cette méthode a permis de mettre en évidence un
renforProbe » ou BFP)
cement de l’attachement induit par des intégrines, ce qui
Cet appareil, réalisé par E. Evans, repose sur l’utilisa- constitue un exemple de la sensibilité de l’attachement
celtion d’une microbille collée à une vésicule dont la tension lulaire aux forces mécaniques (Choquet et al., 1997).
peut être contrôlée par une aspiration variable. Un quartz
piézoélectrique permet d’approcher et d’éloigner la micro- en conclusion : la mesure des solidités
d’attachebille d’une surface qui peut être une cellule maintenue par ment avec une sensibilité voisine du pN et une résolution
une micropipette. En comparaison avec la microscopie à temporelle inférieure à une seconde a montré que
l’adhéforce atomique, cet outil présente deux avantages. D’une sion cellulaire était un processus organisé et progressif, la
part, l’élasticité de la vésicule peut être modifée aisément. formation d’une première liaison étant suivie au bout de
Cette vésicule se comporte donc comme un ressort de rai- quelques secondes de nombreuses liaisons
supplémendeur variable, ce qui a permis d’étendre considérablement taires et d’une réorganisation cellulaire, augmentant ainsi
le domaine de mesure et de disséquer le paysage énergé- considérablement la solidité de l’adhésion. Les
observatique des complexes individuels de biomolécules (Merkel et tions microscopiques que nous allons maintenant décrire
al., 1999 ; Evans et al., 2010). D’autre part, la position de la ont fourni des informations précieuses pour disséquer les
microsphère peut être suivie avec une précision nanomé- mécanismes mis en jeu.
trique et une résolution temporelle élevée (milliseconde) en
combinant une caméra rapide et un système de traitement
étude morphologique de l’adhésion d’image. Ce système a également permis de mesurer avec
une très grande effcacité la formation et la destruction de cellulaire
liaisons en mesurant les fuctuations browniennes de la
Le microscope est certainement l’outil fondamental
microsphère : la formation d’une liaison se traduit par une
de la biologie cellulaire. Nous décrirons brièvement les
diminution brutale de l’amplitude des fuctuations (Chen et
méthodes les plus pertinentes en mentionnant quelques
al., 2008). Cette méthode permet de détecter la formation
exemples illustrant leur apport à la compréhension des et la dissociation des attachements avec une très grande
mécanismes de l’adhésion.
sensibilité. Elle a permis récemment de visualiser la fxation
de lymphocytes T à des surfaces exposant des ligands du Microscopie optique traditionnelle
récepteur de l’antigène, un modèle qui s’est révélé
particuLa formation d’une zone de contact moléculaire est lièrement diffcile à étudier (Huang et al., 2010).
un élément essentiel de l’adhésion cellulaire (fgure 2-5 ).
Autres méthodes Ce processus nécessite un accolement des membranes
plasmiques dont la distance ne doit pas dépasser quelques Une description détaillée de toutes les méthodes
susdizaines de nanomètres, ce qui représente les dimen-ceptibles d’être utilisées pour étudier l’adhésion cellulaire
sions des récepteurs d’adhésion. Avec la résolution de la n’entrerait pas dans le cadre de cette revue. Nous citerons
microscopie optique traditionnelle (au mieux, 200 nm), les seulement deux méthodes relativement simples.
membranes paraissent accolées (Foa et al., 1994). Il a paru •  La  centrifugation a été utilisée pour quantifer
séduisant d’interpréter l’étalement d’une cellule comme la solidité de l’adhésion cellulaire (McClay et al., 1981).
Le principe consiste à laisser des cellules adhérer à des un phénomène passif analogue à l’étalement d’une goutte
liquide étudiée dans le cadre de la physicochimie des sur-surfaces recouvertes de ligands de certaines molécules
membranaires, dans des puits de plaques de culture. Les faces. On peut admettre que la formation de la région de
plaques sont ensuite retournées et centrifugées de manière contact résulte d’un équilibre entre la tension apparente de
la membrane et le travail d’adhésion. La tension apparente à détacher les cellules adhérentes avec une force calibrée.
Les cellules restant fxées au fond des puits sont ensuite de la membrane a pu être estimée à quelques centièmes
20 PARTIE I BIOLOGIE ET ENVIRONNEMENT DES CELLULES EN CULTURE figure 2-5 formation de l’adhésion cellulaire. (a) L’attachement d’une cellule à une surface comporte en règle les processus
suivants : (i) déformation membranaire à l’échelle micrométrique pour former une région de contact apparent en microscopie
optique, (ii) déformation membranaire à l’échelle submicrométrique pour former une région de contacte moléculaire,
(iii) concentration des récepteurs d’adhésion dans la région de contact, (iv) renforcement du cytosquelette sous-membranaire
dans la région de contact. (B) Accolement à l’échelle nanométrique des membranes plasmiques de lymphocytes T agglutinés par
la concanavaline A (d’après Capo et al., 1982). (C) Contentration du récepteur de l’antigène d’un lymphocyte T cytotoxique BM3.3
(cellule située à gauche) attaché à sa cible. La fgure représente une image en lumière visible et une image d’immunofuorescence
(d’après André et al., 1990).
2 3+de mJ/m (par aspiration de leucocytes dans des micro- par exemple le rouge de ruthénium ou les ions La (Foa
pipettes : Evans et Kukan, 1984). Cet ordre de grandeur et al., 1994).
est comparable à celui que pourrait fournir la formation L’observation des images de microscopie électronique
2de quelques centaines de liaisons par mm (en estimant révèle la présence de nombreux replis des membranes
–20l’énergie libre d’association à environ 20 k T, soit 8 10 J plasmiques qui présentent des protrusions (microvilli B
par liaison). Si les couples ligand-récepteurs peuvent se cylindriques ou lamellipodes aplatis) d’une longueur de
déplacer librement dans la région de contact, on peut les quelques dizaines à quelques milliers de nm, et d’une
assimiler à un gaz bidimensionnel engendrant une pres- épaisseur de l’ordre de 100 nm. On peut considérer que
sion également susceptible d’étendre la région de contact ces replis constituent une réserve de membrane qui
per(Bell et al., 1984). Ces modèles sont cependant insuffsants met à l’aire apparente d’augmenter sans que la membrane
pour rendre compte de la formation du contact apparent. plasmique soit étirée de manière signifcative (Mège et al.,
D’une part, la dynamique des mouvements produits par le 1986 ; Hallett and Dewitt, 2007). On sait en effet qu’une
cytosquelette sous-membranaire est mal connue, d’autre bicouche lipidique se rompt lorsqu’on lui impose une
part, il existe un mécanisme actif de régulation de la ten- extension supérieure à 4 % environ (Evans et Skalak, 1980).
sion membranaire qui infuence l’extension du contact Un traitement informatique des images a permis de
calcumoléculaire (Gauthier et al., 2009). ler l’excès d’aire produit par ces replis (Mège et al., 1986).
Il a ainsi été possible d’estimer l’énergie d’adhésion de
Microscopie électronique macrophages péritonéaux de rat à des surfaces planes en
La microscopie électronique permet de visualiser les admettant que le travail d’adhésion déterminait
l’aplatisseinteractions des membranes plasmiques avec une résolu- ment des membranes sur la surface, et en mesurant
l’énertion de l’ordre d’une dizaine de nm. Nous citerons trois gie nécessaire pour induire une augmentation similaire
conclusions remarquables. de l’aire apparente par aspiration dans une micropipette
Bennett (1983) a conclu après avoir observé de (Mège et al., 1987).
nombreuses régions de contact intercellulaires que les L’utilisation de techniques d’immunomarquage
membranes plasmiques (colorées par l’osmium) étaient (immunoperoxydase, immunoferritine) a permis de mettre
en évidence un transfert intercellulaire de molécules souvent étroitement parallèles et séparées par une région
peu dense aux électrons, d’une épaisseur constante de membranaires entre des lymphocytes T cytotoxiques et
quelques dizaines de nm. Il a interprété cette observation leurs cibles (Foa et al., 1985). De nombreuses expériences
en supposant que les membranes cellulaires étaient recou- suggèrent que le transfert intercellulaire de molécules est
vertes d’une région riche en polysaccharide, empêchant le une conséquence relativement fréquente de l’adhésion
celcontact des bicouches lipidiques. Cette région a été appelée lulaire, ce qui pourrait expliquer certaines conséquences
glycocalyx, cell coat ou matrice péricellulaire. Elle a pu être des interactions adhésives. La présentation aux
lymphomise en évidence par des marquages appropriés, comme cytes des antigènes captés par des cellules phagocytaires
chApitre 2 ADHÉSION CELLULAIRE 21constitue un exemple particulièrement étudié (Hudrisier et
Bongrand, 2002).
Microscopies de fuorescence
Les microscopies de fuorescence constituent certai -
nement l’un des outils les plus puissants de la biologie
cellulaire, en associant la sensibilité, un rapport signal/bruit
très élevé, une très grande versatilité, et la possibilité de
mener des études en temps réel. Nous nous bornerons à
énumérer quelques exemples.
•  La  microscopie de fuorescence classique
permet de manière simple et effcace de visualiser un très
grand nombre d’espèces moléculaires. L’observation des
récepteurs d’adhésion a très rapidement montré que les
molécules membranaires subissaient une importante
redistribution dans les régions de contact. En règle
générale, les molécules d’adhésion sont concentrées dans
ces régions (McCloskey et Poo, 1986 ; André et al., 1990),
alors que d’autres molécules, en particulier les molécules
de grande taille, peuvent être exclues (Soler et al., 1997 ;
Leupin et al., 2000 ; Delon et al., 2001) par des mécanismes
passifs de nature stérique ou des mécanismes biologiques figure 2-6 Utilisation de la microscopie à ondes
évanescentes (Tirf) pour étudier le contact cellule-substrat. plus complexes (Delon et al., 2001).
Une cellule de la lignée monocytaire humaine THP-1 a été •  La  microscopie confocale a permis une analyse
incubée en présence d’octadécylrhodamine pour rendre sa beaucoup plus détaillée de la structure des régions de
membrane plasmique fuorescente, et déposée sur une surface contact et a confrmé l’importance de la réorganisation
couverte de fbronectine. L’observation en TIRF révèle des topographique des molécules membranaires. La synapse
zones de contact localisées. Longueur du trait = 5 mm.immunologique (Monks et al., 1998 ; Grakoui et al., 1999)
constitue l’un des exemples les plus étudiés : dans la région
de contact entre les lymphocytes T et les cellules
présen(fgure 2-6 ). Il est ainsi possible de révéler avec une très tatrices d’antigène, on observe en quelques dizaines de
grande précision et une très grande sensibilité les consti-minutes une redistribution conduisant à la concentration
tuants cellulaires situés dans la région de contact en évitant de certaines molécules telles que le récepteur de l’antigène
le bruit de fond engendré par les autres régions cellulaires.(TCR) dans la région centrale alors que l’intégrine LFA-1,
et son ligand ICAM-1 sur la cellule présentatrices, forment
irM (interference refection Microscopy)/riCM
une couronne autour de la région centrale. Le rôle précis
(refection interference Contrast Microscopy)de la synapse immunologique n’est pas encore compris,
mais on peut penser que cette réorganisation membranaire Cette technique est aisément mise en œuvre à partir
infuence la gestion des signaux impliqués dans l’activation d’un microscope à fuorescence inversé au prix de deux
des lymphocytes T mis en présence de l’antigène qu’ils modifcations simples (Verschueren, 1985) : remplacer le
reconnaissent spécifquement. jeu de fltres (fltres d’excitation et d’émission et miroir
•  Plus  récemment  des  développements  tels  que  le  dichroïque) par un miroir semi-réféchissant complété
PALM (Photo-Activated Localization Microscopy) ont éventuellement d’un fltre passe-bande, et utiliser un
permis de localiser de nombreux constituants cellulaires objectif permettant d’éliminer certaines réfexions para -
®à l’échelle nanométrique (Betzig et al., 2006 ; Sherman et sites (le plus utilisé est sans doute l’objectif Zeiss Antifex ).
al., 2011). Il est ainsi possible de commencer à analyser les Le principe du contraste consiste à observer une cellule
assemblages moléculaires qui permettent le développe- déposée sur une lamelle de verre (comme nous l’avons
ment des cascades de signalisation. décrit avec la technique de TIRF) et à réaliser des
interfé•  Le TIRF (Total Internal Refection Fluorescence rences (fgure 2-7 ) entre les rayons réféchis par l’interface
microscopy) est particulièrement adapté à l’étude des inte- verre-milieu et l’interface milieu-cellule. Bien que
l’interprétation quantitative de la formation des images soit com-ractions cellule-substrat. Le principe consiste à déposer des
cellules sur une lamelle de verre éventuellement recouverte plexe (Gingell et Todd, 1979), l’approximation la plus simple
des molécules d’adhésion et à illuminer la région cellulaire (faible angle d’incidence) est souvent utilisée (Zidovska et
adjacente à l’interface lamelle/milieu par une onde évanes- Sackmann, 2006, Pierres et al., 2003 & 2008a) et conduit à
cente (Mattheyses et al., 2010), qui ne dépasse pas une une interprétation semi-quantitative : l’intensité lumineuse
région limitée à une centaine de nanomètres d’épaisseur est minimale lorsque la membrane cellulaire et la lamelle
22 PARTIE I BIOLOGIE ET ENVIRONNEMENT DES CELLULES EN CULTURE figure 2-7 Utilisation du contraste de réfexion pour observer le contact cellule-substrat. Des cellules de la lignée monocytaire
humaine THP-1 ont été déposées sur une surface couverte de fbronectine et observées en microscopie classique ( a) ou IRM (B) : les
contacts cellule-substrat apparaissent en noir. Longueur de la barre : 5 mm.
sont accolées. Lorsque la distance croît, l’intensité lumi- pour approfondir l’interprétation quantitative des images
neuse croît jusqu’à une distance d’un quart de longueur (Theodoly et al., 2010 ; Sengupta et Limozin, 2010).
d’onde (environ 100 nm dans les conditions habituelles
d’éclairement avec une lumière verte de longueur d’onde en conclusion : la combinaison de nombreuses
546 nm dans l’air). L’intensité décroît ensuite et varie de méthodes expérimentales a permis d’obtenir une
descripmanière oscillante en fonction de la distance. La technique tion quantitative du processus d’adhésion : l’approche
d’IRM/RICM est donc bien adaptée à une observation d’une d’une cellule et d’une surface permet à ses récepteurs
région de contact étroit entre la membrane cellulaire et la membranaires de se lier aux ligands parvenant à leur
porlamelle. Cette technique a permis de visualiser la formation tée. L’étape critique est sans doute la formation d’une
de contacts focaux entre des fbroblases et des surfaces de première liaison qui va maintenir la cellule pendant une
verre (Izzard et Lochner, 1976) : les points de contact entre période de temps de l’ordre de la seconde, en résistant à
les cellules et leur environnement peuvent servir de sites de des forces de quelques dizaines de pN au maximum. Cette
nucléation à des assemblages moléculaires, formant rapi- première étape sera suivie d’un renforcement considérable
dement des complexes focaux qui en quelques minutes de l’adhésion : une aire de contact se crée à la suite de
déforsubissent un processus de maturation qui les transforme mations membranaires à l’échelle micrométrique et
nanoen adhésions focales (Zaidel-Bar et al., 2003) organisées métrique. Des récepteurs d’adhésion se concentrent dans
avec une grande précision (Kanchanawong et al., 2010). l’aire de contact et forment des centaines ou des milliers
Elles peuvent regrouper des centaines de molécules (Kuo de liaisons. L’organisation du cytosquelette
sous-membraet al., 2011) et servent à analyser les propriétés des tissus naire consolide la région de contact. L’adhésion peut
environnants. maintenant résister à des forces de quelques dizaines de
Plus récemment, des études en temps réel ont per- nanonewtons. La réorganisation cellulaire infuence pro -
fondément les mécanismes de signalisation intracellulaire, mis de décrire les mouvements membranaires à l’interface
cellule-substrat. L’observation du contact initial entre des ce qui change le comportement de la cellule.
phagocytes mononucléés (Pierres et al., 2008a) ou des lym- Les mécanismes mis en jeu font appel à l’ensemble
phocytes T (Crétel et al., 2010) et des surfaces couplées à des ressources de la cellule et continuent de faire l’objet
des ligands des récepteurs membranaires a ainsi permis de recherches actives. Leur description approfondie
n’ende visualiser des ondulations membranaires de fréquence trerait pas dans le cadre de cette revue. Nous discuterons
élevée (au moins 1 Hz) accompagnant la formation et seulement trois points présentant un intérêt particulier :
l’extension de contacts adhésifs en quelques minutes. Comment l’adhésion est-elle régulée ? Comme une cellule
Parallèlement aux observations de la biologie cellulaire, adhérente se détache-t-elle d’une surface ? Enfn, comment
des travaux ont été réalisés sur des systèmes modèles l’adhésion peut-elle modifer le comportement cellulaire ?
chApitre 2 ADHÉSION CELLULAIRE 23régulation fonctionnelle des récepteurs régulation de l’adhésion cellulaire
d’adhésion : modifcations
L’initiation de l’adhésion peut résulter de l’association conformationnelles
de plusieurs mécanismes que nous décrirons
successiveLes intégrines constituent certainement l’exemple ment, en essayant de suivre l’ordre de leur mise en œuvre.
majeur, à la fois par leur implication dans un très grand
nombre d’interactions adhésives et par l’importance de
régulation de la répulsion stérique leur régulation fonctionnelle. En effet, il est bien établi que
les intégrines présentes sur la membrane de nombreuses Il est logique de considérer que l’une des fonctions
populations cellulaires sont inactives dans les conditions des matrices péricellulaires est d’empêcher l’attachement
de repos. Les mécanismes de contrôle mis en jeu ont fait spontané des bicouches lipidiques. Les forces de répulsion
l’objet de très nombreuses études depuis plusieurs décen-sont dues à la fois à des interactions électrostatiques, dont
nies, et l’importance respective des modifcations confor -la portée est fortement réduite par l’effet d’écran des ions
mationnelles et topographiques a été longtemps débattue. présents dans le milieu, et aux forces engendrées par les
Ces différents mécanismes seront discutés séparément.polymères hydrophiles et parfois fexibles (Bongrand et al.,
Le développement des anticorps monoclonaux a
1982). Cette conception simple est confortée par de
nomrévélé la multiplicité des conformations des intégrines. breuses expériences montrant que l’adhésion cellulaire est
Des anticorps peuvent marquer spécifquement les confor -
facilitée par une réduction des charges ou des
polysacchamations actives, et, ce qui est logique, déplacer l’équilibre
rides cellulaires. Réciproquement, l’augmentation de la
entre différentes conformations. Les expériences réalisées
densité des polysaccharides présents à la surface cellulaire
en phase liquide (Lollo et al., 1993) ou sur les intégrines
peut inhiber l’adhésion (Ardman et al., 1992). Plus
récemmembranaires étudiées à l’échelle individuelle
(Massonment, on a mis en évidence le caractère dynamique de
Gadais et al., 1999 ; Vitte et al., 2004a) ont montré que des
cette interaction : les éléments répulsifs de la membrane
modifcations de conformation des intégrines pouvaient
s’écartent des régions de contact (Soler et al., 1997 ; Leupin
augmenter considérablement leur activité, essentiellement
et al., 2000). Il est intéressant de noter que certaines
expéen réduisant la constante de dissociation mais aussi en
riences suggèrent que cet éloignement résulte d’un
mécaaugmentant la constante d’association. Plus récemment,
nisme cellulaire actif, et non pas seulement de la diffusion
les bases structurales de ces modifcations ont été analy -
passive : l’activation des phagocytes mononucléés
s’acsées : on a en particulier distingué trois états fonctionnels
compagne d’une réduction active de l’expression ou de la
d’intégrines telles que LFA-1 : courbée et inactive,
redressialylation de la molécule membranaire répulsive CD43, et
sée et présentant une affnité moyenne, redressée et pré -
cette réduction facilite la capture de particules
interagissentant une affnité élevée (Luo et al., 2007).
sant avec des récepteurs membranaires (Sabri et al., 2000).
D’autre part, au cours de l’interaction des lymphocytes T
avec des cellules présentatrices d’antigène, la molécule Microagrégation (clustering)
CD43 est exclue de la région de contact par un mécanisme
L’effcacité des récepteurs d’adhésion peut être consi -
actif mettant en jeu son interaction avec la moésine (Delon
dérablement augmentée s’ils ont la capacité de former des
et al., 2001).
liaisons multiples (Seifert, 2000). Cette capacité est
certainement un élément important de l’avidité d’un récepteur
(Bongrand, 2012). Il est donc intéressant de noter qu’il régulation de l’expression des récepteurs
est bien établi que l’activité fonctionnelles des intégrines d’adhésion
est en règle fortement augmentée lorsque ces molécules
Ce mécanisme joue très souvent un rôle majeur dans sont organisées en agrégats de quelques molécules
seul’initiation de l’adhésion. Par exemple, le déclenchement lement (Detmers et al., 1987 ; Cambi et al., 2006). Le rôle
d’une réaction infammatoire est souvent lié à l’expression fonctionnel de ce clustering a pu être démontré
directede récepteurs d’adhésion à la surface des cellules endo- ment : lorsque le constituant C3bi du complément a été
théliales de la région concernée : la P-sélectine, stockée couplé à la surface d’hématies de manière homogène ou
dans les granules de Weibel-Palade, peut être exocytée en sous forme d’agrégat, cette dernière préparation induisait
quelques minutes. L’expression d’autres molécules d’adhé- beaucoup plus effcacement la phagocytose des hématies
sion telles que la E-sélectine et VCAM-1 suivra en quelques par des macrophages exprimant des récepteurs du C3bi
heures à quelques dizaines d’heures. Par ailleurs, de très (Hermanowski-Vosatka et al., 1988). Plus récemment,
nombreux médiateurs peuvent induire l’expression de lorsque des anticorps monoclonaux « neutres » ont été
utimolécules d’adhésion, en particulier des substances bac- lisés pour obtenir une microagrégation des intégrines α5b1
tériennes telles que les lipopolysaccharides bactériens ou sur des cellules de la lignée monocytaire THP-1, sans
modide nombreuses cytokines telles que l’interleukine 1 ou le fer leur conformation, la capacité de ces cellules de s’atta -
tumor necrosis factor alpha (Harlan et Liu, 1992). cher à des surfaces couvertes de fbronectine, un ligand de
24 PARTIE I BIOLOGIE ET ENVIRONNEMENT DES CELLULES EN CULTURE α5b1, a été fortement augmentée dans une chambre à fux LFA-1. Réciproquement, l’attachement au cytosquelette
laminaire (Vitte et al., 2004a). peut modifer certaines propriétés des récepteurs d’ad -
hésion et, en particulier, la solidité de leur liaison avec la
surface cellulaire. Des mutants de L-sélectine présentant
Localisation des récepteurs sur une troncature d’un segment intracytoplasmique avaient
les extrémités des protrusions à la fois un défaut d’attachement à l’alpha-actinine et un
membranaires défcit de la capacité d’induire le roulement cellulaire sur
des surfaces portant des ligands de cette L-sélectine (Dwir
La microscopie électronique, en transmission ou à
et al., 2001). De même, des mutants du ligand PSGL-1 balayage, montre bien que les membranes cellulaires sont
de certaines sélectines, qui avaient été dépourvues d’un
en règle générale hérissées de protrusions de dimensions
domaine intracytoplasmique interagissant avec la moé-variables (de quelques dizaines de nm à quelques mm).
sine (une protéine ERM impliquée dans l’association du
Il est raisonnable de penser que l’effcacité adhésive des
cytosquelette avec la membrane plasmique), présentaient
récepteurs membranaires doit être bien plus élevée lorsque
un défcit de l’induction du roulement alors que ces molé -
ceux-ci sont localisés à l’extrémité de ces protrusions. Cette
cules fxaient normalement des ligands solubles (Snapp et
hypothèse a été vérifée expérimentalement : l’accrochage
al., 2002).
des leucocytes du sang aux cellules endothéliales exprimant
le ligand de la L-sélectine nécessite que cette sélectine soit
en conclusion : il existe de très nombreux méca-concentrée au sommet des microvilli. En effet, lorsqu’une
nismes de régulation permettant aux cellules vivantes
sélectine chimérique possédant une région
transmembrade contrôler leur adhésion aux surfaces environnantes.
naire d’une autre molécule (CD44) a été introduite par
Cette multiplicité s’accorde avec l’importance
fondamentransfection dans des cellules lymphoïdes, la capacité
d’intale des interactions adhésives dans les interactions
celteraction dynamique avec son ligand a été abolie, alors que
lulaires. Cependant, alors que les mécanismes que nous
les sites de reconnaissance étaient intacts (Von Andrian et
avons décrits s’appliquent à l’induction de l’attachement,
al., 1995 ; Buscher et al., 2010). Il est intéressant de noter
il convient de noter que le détachement d’une cellule
adhéque ce mécanisme simple a pu être effectivement mis en
rente fait appel à des mécanismes de nature différente. Ce
œuvre par des cellules dans le but de réguler leur activité
point sera brièvement mentionné dans la section
ci-desadhésive : ainsi, des étude de microscopie électronique ont
sous.
montré que l’intégrine Mac-1 (CD11bCD18) était
essentiellement réalisée sur le corps cellulaire de granulocytes
neutrophiles au repos. Après activation, cette molécule se
retrouvait sur les microvilli (Erlandsen et al., 1993). Nous Contrôle du détachement
avons déjà mentionné que l’activation des cellules pha- des cellules adhérentes
gocytaires était corrélée à une activation fonctionnelle de
CD11bCD18 (Detmers et al., 1987). Les mécanismes de déadhésion ont été notablement
moins étudiés que les mécanismes d’attachement. Les
expériences réalisées démontrent néanmoins leur multipli-Modifcation de l’interaction
cité. Il est certainement aussi important pour une cellule des récepteurs d’adhésion avec
de pouvoir contrôler son détachement que de déclencher le cytosquelette d’actine
une interaction adhésive, et l’on a rapporté des exemples
Les conséquences fonctionnelles de l’interaction du de déclenchement actif du détachement cellulaire, par
exemple la séparation de lymphocytes B et T (Mazerolles et cytosquelette d’actine avec les récepteurs d’adhésion ne
al., 1994). Nous citerons rapidement quelques mécanismes.sont pas univoques, et l’inhibition de la polymérisation
d’actine chez des lymphocytes a pu soit favoriser, soi
inhiber l’activité de l’intégrine LFA-1 suivant l’état d’activation Modifcations conformationnelles
de ces lymphocytes (Lub et al., 1997). Il est possible de
suggérer quelques éléments d’interprétation. L’association de Il serait tentant d’expliquer le détachement de
celrécepteurs au cytosquelette peut décroître leur mobilité lules liées à une surface par des intégrines en
suppolatérale, ce qui peut gêner leur activité. Cette hypothèse sant qu’il existe des signaux permettant d’induire chez
s’accorde avec une étude effectuée sur la mobilité de l’in- ces intégrines le passage à des conformations inactives.
tégrine LFA-1 au moyen de la technique de single particle Cette hypothèse n’est soutenue que par de rares données
tracking (Kucik et al., 1996) : le traitement par un ester de expérimentales (Chigaev et al., 2008). Un raisonnement
phorbol ou de faibles doses de cytochalasine D de cellules thermodynamique simple montre bien que la fxation
exprimant LFA-1 a de manière concomitante augmenté la d’une intégrine à son ligand doit stabiliser la
conformamobilité latérale de cette intégrine et la capacité cellulaire tion active, ce qui peut rendre plus diffcile le retour à une
de se lier à des substrats exposant le ligand ICAM-1 de conformation inactive.
chApitre 2 ADHÉSION CELLULAIRE 25s’éloignent de la zone de contact. Réciproquement, il rupture mécanique des liaisons
serait séduisant de penser que la cellule puisse utiliser une
Comme nous l’avons rappelé, le déplacement d’une concentration locale de molécules anti-adhésives telles
cellule sur une surface repose sur un cycle de processus que la leukosialine CD43 pour faciliter la déadhésion. Cette
d’attachement (à l’avant) et de détachement (à l’arrière). hypothèse a été suggérée lorsqu’il a été constaté que la
On a pu induire la rupture d’adhésions focales chez des molécule anti-adhésive CD43 se concentrait dans la région
fbroblastes perméabilisés en induisant une contraction par postérieure des granulocytes en déplacement (Seveau et
addition d’ATP, et cette rupture était abolie par l’addition al., 2000).
d’un heptapeptide qui inhibait l’interaction actine-myosine
(Crowley et al., 1995). De même, un défcit de la myosine II en conclusion : de nombreux travaux montrent que
peut diminuer la migration cellulaire sur les substrats d’ad- le détachement d’une cellule adhérant à un substrat peut
hésivité excessive (Jay et al., 1995). Il est également intéres- nécessiter des mécanismes spécifques, qui ne corres -
sant de noter qu’un défcit de migration des neutrophiles pondent pas à la réversion fdèle des mécanismes d’atta -
lié à une adhésion excessive peut être compensé par une chement. De même que l’adhésion, la déadhésion est un
activation de RhoA, qui est connu pour augmenter les forces phénomène actif et hautement coordonné.
de tension intracellulaire en activant la myosine II (Cavnar Comme le suggèrent les quelques exemples cités dans
l’introduction de cette revue, l’importance du contrôle de et al., 2011). Au contraire, l’inhibition de RhoA ou de l’une
de ses cibles (ROCK) altère la capacité de détachement de la l’adhésion cellulaire dépasse le domaine du contrôle de la
migration. L’adhésion modife en effet de très nombreux région arrière des granulocytes (Alblas et al., 2001).
aspects du comportement cellulaire. Les mécanismes mis
en jeu font actuellement l’objet de nombreux travaux et Diminution de la rigidité membranaire
restent incomplètement compris. Nous décrirons
seuleNous avons indiqué que l’adhésion cellulaire s’ac- ment quelques concepts fondamentaux.
compagnait souvent d’un renforcement du cytosquelette
d’actine dans la région de contact, ce qui suggère une
Comment l’adhésion à augmentation de la rigidité locale. En effet, séparer deux
surfaces rigides attachées par des liaisons ligand-récepteur un substrat peut-elle modifer
nécessite la rupture simultanée de plusieurs liaisons, alors le comportement cellulaire ?
que des surfaces fexibles peuvent se détacher à la suite de
la rupture séquentielle des liaisons en réponse à une force Le comportement cellulaire est déterminé par la
généplus faible. Cette hypothèse simple est confrmée par des ration de cascades de réactions biochimiques et par la
difdonnées expérimentales : le traitement par la trypsine de fusion des réactifs engendrés par ces cascades. Quelques
fbrolastes adhérant à une surface conduit à leur détache - exemples illustrent la complexité de ces phénomènes :
ment, mais ce détachement est gêné lorsque la rigidité dans une revue récente décrivant l’activation des
lymphocellulaire est augmentée par un traitement par la concana- cytes T, un schéma simplifé du complexe de signalisation
valine A (Badley et al., 1981). proximale engendré par l’activation du récepteur de
l’antigène (TCR) montre l’assemblage d’une quinzaine de
molécules différentes (Smith-Garvin et al., 2009), ce qui peut Protéolyse de molécules impliquées
être considéré comme une simplifcation importante. Une dans l’adhésion
compilation assez récente des molécules rassemblées dans
La protéolyse du substrat pourrait constituer un méca- les adhésions focales initiées par les intégrines retrouvait
nisme de déadhésion : l’élastase est une protéase largement 156 constituants (Zaidel-Bar et al., 2007). Plus récemment,
exprimée à la surface des granulocytes neutrophiles et qui un étude protéomique plus exhaustive mentionnait 905
se lie à l’intégrine CD11bCD18/MAC-1/CRIII, qui est un protéines associées aux adhésions focales (Kuo et al., 2011),
récepteur du fbrinogène. On a montré que des anticorps ce qui peut représenter le dixième des protéines exprimées
anti-élastase inhibaient le détachement de cellules adhérant par les cellules étudiées. Il est donc clair que les schémas
au fbrinogène (Cai et al., 1996). Cette hypothèse a été confr - dont nous disposons restent extrêmement schématiques.
mée par des travaux plus récents, montrant qu’un défcit de Nous nous bornerons à citer cinq mécanismes non
exclusécrétion d’élastase entraînait une inhibition du détache- sifs potentiellement responsables de l’infuence de l’adhé -
ment de l’uropode des granulocytes (Singh et al., 2012). sion sur le comportement cellulaire.
insertion d’éléments répulsifs dans Signaux engendrés par l’occupation
la zone d’adhésion des récepteurs d’adhésion
Nous avons vu que l’adhésion cellulaire pouvait néces- Les membranes plasmiques sont associées à de très
siter que certaines molécules de grande taille, anti-adhésives, nombreux récepteurs qui servent aux cellules à analyser
26 PARTIE I BIOLOGIE ET ENVIRONNEMENT DES CELLULES EN CULTURE leur environnement pour adapter leur comportement. La contact avec une cellule. Des expériences modèles ont bien
régulation hormonale constitue un exemple bien connu. démontré la réalité de ce mécanisme : on peut induire la
fusion de macrophages déposés sur une surface portant des Le chimiotactisme illustre particulièrement cette
situation : un leucocyte peut détecter une différence relative de sites reconnus par des intégrines (RGD et le site synergique
quelques centièmes seulement entre les concentrations de PHSRN) si leur topographie est adéquate, ce qui pourrait
mimer l’effet de la fbronectine (Kao et al., 2001). D’autre facteurs chimiotactiques à ses extrémités (Zigmond, 1977).
L’adhésion à une surface portant des ligands des récep- part, les contraintes stériques dans les régions d’adhésion
peuvent modifer la composition protéique membranaire teurs membranaires doit donc entraîner la génération de
locale : du fait des multiples interactions moléculaires signaux par ces récepteurs.
mettant en jeu les protéines et les lipides membranaires, Cependant, de nombreuses expériences montrent
le départ ou le recrutement d’un petit nombre d’espèces souvent que les ligands d’un récepteur donné peuvent
moléculaires peut suffre à modifer profondément la activer beaucoup plus effcacement les récepteurs qui les
nature des molécules présentes dans la région d’interaction reconnaissent lorsqu’ils sont fxés à des surfaces que lorsque
(Ukena et al., 1972 ; Norambuena et Schwartz, 2011), et à qu’ils sont en phase soluble. Le récepteur des lymphocytes
modifer ainsi les conditions de signalisation, par exemple T (TCR) constitue un exemple particulièrement bien étudié
l’équilibre entre les phosphorylations et les déphosphoryla-(Mescher, 1992 ; Ma et al., 2008). Cette constatation
s’extions (Leupin et al., 2000).plique par la multiplicité des mécanismes qui permettent à
un récepteur de déclencher un signal après avoir reconnu
son ligand. Le mécanisme le plus familier est peut-être un Génération de forces et
changement de conformation du récepteur à la suite de
mécanotransduction à l’interface
la fxation du ligand. C’est par exemple le mode de fonc -
cellule-substrattionnement des récepteurs « classiques » (trimériques) à
protéine G. Ce mécanisme peut s’appliquer aussi bien à la On sait depuis longtemps que les cellule fxées à un
fxation d’une molécule soluble ou adsorbée sur une sur - substrat exercent des forces sur celui-ci (Harris et al., 1980).
face. Cependant, d’autres mécanismes de transduction que Plus récemment il est apparu que les cellules adhérentes
nous allons maintenant discuter s’appliquent surtout, et percevaient la rigidité du substrat sous-jacent (Lo et al.,
parfois exclusivement, à l’interaction d’un récepteur avec 2000 ; Engler et al., 2006). Il est également démontré que
une molécule liée à une surface (Pierres et al., 2009). l’application de forces sur des cellules peut engendrer des
signaux tels qu’une augmentation du calcium cytosolique
(Horoyan et al., 1990 ; c’est la mécanotransduction), et que regroupement de quelques molécules
les cellules peuvent percevoir à la fois les forces exogènes
susceptibles d’interagir pour produire et les tensions résultant de l’interaction des forces qu’elles
un signal produisent avec les surfaces qui les entourent (Kobayashi
et Sokabe, 2010). La mécanotransduction fait actuellement Comme nous l’avons rappelé, la génération d’un signal
l’objet d’études très actives. Nous nous bornerons à citer par un récepteur va, en règle générale, résulter de la
formaquelques mécanismes non exclusifs dont la réalité est sug-tion d’un assemblage moléculaire spécifque qui conduira
gérée par des données expérimentales. D’autres exemples à l’activation de certaines molécules, par exemple à la suite
peuvent être trouvés dans une revue récente (Pierres et al., d’évènements de phosphorylation spécifques. Le simple
2009).fait de regrouper des molécules peut donc initier une
cascade biochimique. L’exemple le plus simple est celui de
Canaux mécanosensibles
l’agrégation de récepteurs dont la partie cytoplasmique
On a depuis longtemps mis en évidence chez les bac-porte à la fois une kinase et des sites de phosphorylation : la
téries des canaux ioniques sensibles à la tension membra-simple dimérisation du récepteur permettra à la kinase de
naire. Plus récemment, des études de microscopie en temps phosphoryler son substrat, ce qui conduira à l’apparition de
réel ont montré que des forces exogènes (Hayakawa et al., nouveaux sites de reconnaissance susceptibles de recruter
2008) ou endogènes (Wei et al., 2009) pouvaient provoquer d’autres molécules. Un mécanisme plus complexe repose
des montées calciques transitoires que l’on pouvait attri-sur la multiplicité des sites d’interaction constitutivement
buer à l’ouverture de canaux calciques mécanosensibles.portés par la plupart des protéines : au moins une dizaine
de sites par protéines si l’on considère les bases de données
induction de sites de recrutement de molécules relatives à l’interactome (Chaurasia et al., 2009) . Le simple
de signalisationfait de rapprocher une combinaison spécifque de proté -
ines peut donc suffre à initier un assemblage moléculaire. Plusieurs études montrent que des forces faibles (de
La répartition topographique des ligands exprimés par une l’ordre du pN) peuvent provoquer des modifcations de
surface peut donc déterminer la nature des assemblages et, conformation de protéines associées aux membranes et/
par conséquent, des signaux qui seront induits à la suite du ou au cytosquelette, induisant ainsi l’apparition de sites de
chApitre 2 ADHÉSION CELLULAIRE 27phosphorylation (Sawada et al., 2006) ou de recrutement et nous terminerons en mentionnant des modèles qui ont
de molécules susceptibles d’interagir avec le cytosquelette été proposés pour expliquer cette constatation.
(Del Rio et al., 2009).
L’étalement infuence le comportement cellulaire
Modifcation des interactions moléculaires La survie de nombreuses cellules nécessite leur
attachement à une surface. Par exemple, des cellules endo-Comme nous l’avons indiqué, la génération de signaux
théliales déposées sur des surfaces couvertes de ligands intracellulaires résulte de la formation d’assemblages
spédes intégrines membranaires (fbronectine ou vitronec -cifques dont la composition dépend à la fois de la nature
tine) s’étalaient et restaient vivantes, alors que ces mêmes des rencontres intermoléculaires et des forces
d’interaccellules restaient arrondies et entamaient un proces-tion. On sait que l’application de forces peut modifer signi -
sus d’apoptose si la concentration de fbronectine ou de fcativement la durée de vie des interactions moléculaires,
vitronectine était insuffsante. La survie ne résultait pas le plus souvent en la réduisant mais parfois,
paradoxaleseulement de l’occupation des intégrines car l’apoptose ment, en l’augmentant (Bongrand, 1999). Récemment, on
ne pouvaient être prévenue lorsque les ligands des inté-a démontré que ces principes s’appliquaient aux adhésions
grines étaient ajoutés en solution ou même sur la surface focales : les forces engendrées par les fbres de contrainte
de microsphères qui se liaient aux cellules sans entraîner (stress fbers ) au moyen d’une interaction actine-myosine
d’étalement (Re et al., 1994). Des conclusions similaires ont
modifent effectivement la vitesse de renouvellement de
été obtenues lorsque des cellules ont été déposées sur des
molécules telles que la vinculine, la paxilline ou la zyxine
îlots adhésifs de dimensions variables : la survie cellulaire
(Wolfenson et al., 2011).
nécessitait que les cellules soient étalées, plutôt que de
disposer d’une aire de contact suffsante avec des ligands des Modifcation de la courbure membranaire
intégrines (Chen et al., 1997).
L’application de forces sur la membrane peut cau- De même, lorsque des cellules RBL ont été déposées
ser des modifcations de courbures, ce qui peut entraîner sur des surfaces rendues adhésives par plusieurs
traitele recrutement de protéines susceptibles d’infuencer les ments différents, il est apparu que seul l’étalement, et pas
assemblages moléculaires responsables de la génération de seulement l’adhésion, augmentait la capacité d’exocytose
cascades de signalisation (Suetsugu et al., 2006JBC). de ces cellules (Apgar, 1997).
Modèles d’explication des relations entre la forme Contrôle de l’organisation
et l’activité cellulairedu cytosquelette
Plusieurs modèles théoriques ont été proposés pour
Les interactions adhésives s’accompagnent
fréquemexpliquer les relations entre la forme et le comportement
ment d’un renforcement du cytosquelette d’actine dans
cellulaire.
la région d’interaction (André et al., 1990). On peut citer
Meyers et al. (2006) ont proposé un modèle en
preau moins deux mécanismes non exclusifs permettant au
nant l’exemple de protéines G dont on connaît bien le rôle
cytosquelette d’infuencer les mécanismes de signalisation
de commutateur : la forme liée à un groupement GTP est
intracellulaires : d’une part, en modifant les conditions de active et se trouve inactivée lorsque le GTP est transformé
rencontre des molécules intracytoplasmiques [en faisant en GDP à la suite de l’hydrolyse d’un phosphate. La
régulaoffce de site de nucléation (Forgacs, 2004), ou en rempla - tion de ces protéines repose sur un équilibre entre les GEF
çant la diffusion tridimensionnelle par une diffusion uni- (guanine nucleotide exchange factors) qui catalysent le
dimensionnelle] ; d’autre part en facilitant la transmission remplacement du GDP par un GTP, qui est généralement
de l’information d’un point à l’autre de la cellule (Forgacs, en excès en phase soluble, et les GAP (GTPases activating
1995 ; Wang et Suo, 2005). proteins) qui facilitent l’hydrolyse. Meyers et al. ont
remarqué que si les GEF étaient liées aux membranes cellulaires,
les GAP restant dans la phase soluble et les protéines G importance de l’étalement : effet de
diffusant du cytoplasme aux membranes et réciproque-la forme sur le comportement cellulaire
ment, la proportion de protéines G actives devait être
Nous avons indiqué dans la première partie de cette inversement proportionnelle à la longueur des
déplacerevue que l’adhésion d’une cellule à une surface pouvait ments de ces protéines G dans le cytoplasme entre deux
induire d’importantes modifcations morphologiques rencontres avec la membrane : cette longueur doit être
constituant le phénomène d’étalement (Pierres et al., 2002). plus élevée chez une cellule arrondie que chez une
celCe phénomène est d’autant plus important que de nom- lule aplatie. Un modèle de principe similaire a été proposé
breuses expériences montrent que la forme d’une cellule par Haugh (2007). Un modèle plus complexe a été
dévepeut fortement infuencer son comportement (Crétel et al, loppé par Neves et al. (Neves et al., 2008 ; Neves et Iyengar,
2008). Nous citerons quelques expériences représentatives 2009) sur le modèle de l’activation d’une MAP-kinase par
28 PARTIE I BIOLOGIE ET ENVIRONNEMENT DES CELLULES EN CULTURE les récepteurs bêta-adrénergiques dans ces cellules neu- Bell GI, Dembo M, Bongrand P. (1984) Cell adhesion:competition
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32 PARTIE I BIOLOGIE ET ENVIRONNEMENT DES CELLULES EN CULTURE variabilité non génétique 3dans les cultures
cellulaires
G. CoRRE, D. SToCKHoLM, A. PALDI
La culture de cellules est un des outils de choix au cipalement par la manipulation de micro-organismes
baclaboratoire. Qu’il s’agisse de recherche fondamentale ou tériens tels qu’Escherichia coli, qui est alors l’organisme le
d’applications biotechnologiques, elle permet aujourd’hui plus étudié. À cette époque, la majeure partie des mises en
de disposer facilement et rapidement de matériel biolo- évidence de l’hétérogénéité entre cellules est uniquement
gique. En maîtrisant les paramètres physicochimiques des le fait d’observations.
conditions de culture et la traçabilité des cellules, la culture L’hétérogénéité phénotypique a depuis été mise en
in vitro permet d’effectuer des expériences standardisées. évidence dans de nombreux types cellulaires, de la bactérie
En fonction des expériences, des cellules primaires aux cellules eucaryotes supérieures. Cultivées dans un
enviou plus fréquemment des lignées de cellules peuvent être ronnement homogène, des cellules isogéniques peuvent se
utilisées. Établies depuis parfois plusieurs décennies (cel- comporter différemment en réponse à un stimulus.
lules HeLa par exemple), ces lignées bien caractérisées Une des premières caractérisations revient à Max
sont utilisées dans de nombreux laboratoires autour du Delbrück, un biophysicien, qui observe une grande
variamonde qui voient en elles un matériel biologique standard. bilité intercellulaire lorsqu’il quantife le nombre de phages
Souvent établies par clonage, on leur prête donc un haut produits par des bactéries infectées.
niveau d’homogénéité. En effet, il semble évident que des En 1944, Bigger et al. montrent que dans une
populacellules possédant le même programme génétique doivent tion isogénique de staphylocoques traitée par un
antibiose comporter de façon similaire lorsqu’elles évoluent dans tique, la pénicilline, une sous-population de bactéries survit
le même environnement. au traitement grâce à l’arrêt de son cycle cellulaire. Après
Malgré cette promesse d’homogénéité, il n’est pas rare arrêt du traitement, ces cellules se divisent à nouveau, mais
de voir apparaître des différences entre les cellules d’une demeurent néanmoins sensibles à l’antibiotique, ce qui les
culture in vitro, bien que la population cellulaire soit iso- rend différentes de cellules ayant acquis une résistance par
génique et cultivée dans un environnement homogène. Les mutations génétiques. Ce phénomène a depuis été observé
cellules d’une telle population possèdent donc la capacité dans d’autres espèces de bactéries, notamment E. coli.
de changer leur phénotype, parfois sans aucune infuence Un comportement analogue existe chez la bactérie
externe. La diversifcation des cellules est donc le produit Bacillus subtilis où est observé un état dit de «
compéde la population elle-même et, de toute évidence, le résul- tence » dans certaines cellules d’une population isogénique
tat d’un processus que l’on qualife d’« épigénétique » car (Nester et Stocker, 1963 ; Cahn et Fox, 1968 ; Hadden et
toutes les cellules sont génétiquement identiques. Nester, 1968). C’est un état temporaire et réversible. De
Cette observation soulève plusieurs questions d’ordre façon intéressante, seule une partie des cellules d’une
colofondamental, mais aussi d’ordre pratique si la culture est
nie (environ 10 %) peut l’acquérir à un instant donné.
utilisée dans un objectif de recherche fondamentale ou Novick et Weiner (1957) ont montré que la
producpour des applications biotechnologiques.
tion de b-galactosidase par des cellules bactériennes
individuelles isogéniques soumises au même stimulus était
hautement variable et aléatoire.
En étudiant le chimiotactisme de bactéries indivi-historique
duelles stimulées par un attractant, Spudich et Koshland
(1976) observent que le temps de réponse pour la modif -Le concept de variabilité intercellules a émergé
bien avant la biologie moléculaire des années 1980, prin- cation de la nage varie énormément d’un individu à l’autre,
33malgré leur identité génétique. Ils parlent alors, probable- Les techniques comme la PCR, le Western Blot,
ment pour la première fois, « d’individualité non géné- l’ELISA… sont souvent suffsantes pour montrer qu’un
tique » pour qualifer cette variabilité interindividuelle. traitement a un effet global se traduisant à l’échelle de la
Berg et Purcell (1977) étudient la précision avec population. Néanmoins, leur inconvénient est que le
résullaquelle des bactéries peuvent estimer la quantité d’at- tat obtenu est une moyenne du comportement de la
poputractants dans son environnement. Cette précision semble lation de cellules pour la variable d’intérêt (fgure 3-1 ).
limitée par la diffusion du ligand à la surface des cellules Aucune information sur une sous-population ou des
indiviimpliquant une fuctuation de la quantité des récepteurs dus atypiques ne peut être obtenue (Altschuler et Wu, 2010).
à ce ligand. De façon automatique et puisque les cellules sont
Les premières observations sur des cellules eucaryotes d’origine clonale et cultivées dans un environnement
datent des années 1960, mais sont moins abouties compte homogène, on transpose à chaque individu un effet global
tenu de la complexité de ces cellules par rapport aux bac- mesuré sur cette population. Cette simplifcation est accep -
téries. Peu d’eucaryotes supérieurs sont utilisés comme table si l’on cherche à mettre en évidence un
comportemodèles, mis à part la levure. Néanmoins, une large varia- ment global, mais il peut ne pas reféter le comportement
bilité est également observée, notamment de la taille des
des individus. Par exemple, on peut estimer que
l’exprescellules, de leur indice de prolifération, de leur mobilité ou sion d’un gène est dose-dépendante suite à une
inducde la durée du cycle cellulaire, suggérant que
l’hétérogétion en observant l’expression dans la population alors
néité est aussi une caractéristique importante des cellules
qu’à l’échelle cellulaire, l’expression est de type binaire
eucaryotes.
(fgure 3-2 ). L’expression au sein de chaque cellule
n’augmente pas de façon proportionnelle à l’induction, mais
c’est la proportion de cellules exprimant le gène d’intérêt
qui augmente dans la population. Avec une approche glo-Cellule unique et population
bale, il est impossible de différencier ces deux dynamiques.cellulaire
L’utilisation massive de ce genre de techniques a
masqué des phénomènes que nous découvrons aujourd’hui Mettre en évidence l’hétérogénéité d’une population
grâce à l’émergence de nouvelles techniques basées sur cellulaire nécessite de travailler à l’échelle cellulaire afn
l’analyse de cellules uniques. Il est donc essentiel de tra-de mettre en évidence des différences entre individus.
vailler à l’échelle individuelle pour mettre en évidence des Aujourd’hui, la plupart des expériences sont réalisées sur
comportements cellulaires uniques. Ces dernières années des échantillons contenant un grand nombre d’individus,
par commodité mais aussi pour répondre aux limites des ont vu l’amélioration considérable de l’instrumentation en
termes de sensibilité, de rapidité et de robustesse. Ces outils techniques (notamment d’extraction d’ADN, d’ARN ou de
protéines). ont permis de mieux détecter la variabilité entre cellules,
figure 3-1 homogénéisation des comportements individuels par les techniques d’analyse sur population. (m = moyenne,
s= variance). L’analyse de la population en tant qu’entité donne le même résultat dans les deux cas alors que le comportement des
individus dans chacune des populations est différent. L’information sur la variabilité dans la population est perdue si les individus
sont mélangés. En effet, on résume leur comportement à celui de la population. Dans certains cas (population de gauche), cette
estimation est acceptable dans le sens où la moyenne est conforme à l’ensemble des individus. Toutefois, dans certains cas, elle ne
décrit le comportement d’aucun des individus (population de droite).
34 PARTIE I BIOLOGIE ET ENVIRONNEMENT DES CELLULES EN CULTURE figure 3-2 L’analyse sur population masque les dynamiques individuelles. Ainsi, sous différentes doses d’inducteur, un même
niveau d’expression observé peut reféter différentes dynamiques des individus de la population. Dans le premier cas, la moyenne
croissante observée dans la population suite à l’induction correspond à une augmentation de l’intensité de la réponse de chaque
individu. Dans le second cas, c’est la proportion de cellules positives qui augmente dans la population, la moyenne observée ne
refétant pas le comportement des individus. La distinction entre ces deux dynamiques est impossible sans analyse individuelle.
mais aussi de passer de son observation à sa quantifcation d’augmenter la variabilité du résultat de l’expérience. La
(Arriaga, 2009). logique des mécanismes impliqués dans le changement
Parmi les techniques d’analyse sur cellule unique, phénotypique peut être divisée en deux modèles simples :
l’imagerie et la cytométrie en fux sont les plus utilisées. La un mécanisme interne et un mécanisme externe à la cellule.
microscopie est la technique la plus à même d’offrir une
résolution à l’échelle de la cellule unique car elle permet de
visualiser directement le phénomène d’intérêt. Elle permet
fluctuations d’origine internebien sûr de contrôler visuellement les échantillons
(observation statique), mais elle autorise aussi la réalisation
d’exElles correspondent par défnition à tout ce qui est
périences en temps réel grâce à l’intégration du système
spécifque à une cellule et qui conduit à une différence d’imagerie dans un environnement contrôlé.
entre deux cellules génétiquement identiques.
La cytométrie en fux (CMF) est le plus souvent utili -
sée pour analyser à grande vitesse des milliers de cellules
et c’est la technique de référence pour étudier le cycle Bruit moléculaire : la loi
cellulaire (voir chapitre 11). La CMF est rarement utilisée des petits nombres
pour mesurer des variations à l’intérieur d’une population
Les systèmes cellulaires (bactérie, levure ou cellules homogène, ce qui est assez surprenant compte tenu des
eucaryotes supérieures) sont des structures de petite taille différences de fuorescence observées dans la plupart des
dans lesquelles se déroulent de nombreuses réactions bio-articles scientifques utilisant cette technique. En effet, le
chimiques nécessaires à leur survie. L’effcacité de chacune marquage fuorescent de certaines molécules membra -
de ces réactions biochimiques dépend de nombreux fac-naires se répartit parfois sur 2 ou 3 log d’intensité sans être
teurs biologiques et physiques (température, pH…) et, en commenté. La présence de cent fois plus de molécules à
particulier, la concentration de substrat. En réalité, il existe la surface de certaines cellules est-elle sans conséquence ?
Cette constatation montre que la prise en compte de la parfois un très faible nombre de partenaires moléculaires
dans une cellule. De même, la quantité de cofacteurs peut variabilité reste anecdotique, même si de plus en plus
d’articles y prêtent attention. être limitée, réduisant ainsi l’effcacité de certaines réac -
tions biochimiques. Cet aspect quantitatif est très impor-Les fuctuations phénotypiques peuvent être de nature
diverses dans une culture cellulaire et sont susceptibles tant puisqu’il fait des réactions biochimiques un processus
chApitre 3 VARIABILITÉ NON GÉNÉTIQUE DANS LES CULTURES CELLULAIRES 35hautement probabiliste gouverné par les lois de la diffu- prennent en compte l’export des ARNm, la taille de la
celsion. La taille du système et le nombre de partenaires sont lule ou la dynamique du noyau comme sources de
variabilité (Coulon et al., 2010).donc des variables de première importance.
L’expression génique ne fait pas exception. Nous Chez les eucaryotes, l’ADN est confné dans le noyau
de la cellule. Il est associé à diverses protéines pour for-connaissons à présent beaucoup de détails moléculaires
mer un complexe nucléoprotéique appelé chromatine. des différentes étapes de l’expression génique, tant chez
Celle-ci joue un rôle structural important en structurant en les procaryotes que chez les eucaryotes. Chaque livre de
différents niveaux d’organisation les 2 mètres d’ADN que biologie moléculaire regorge de schémas toujours plus
contient chaque cellule (humaine). Grâce à sa fexibilité, complexes décrivant les différents partenaires moléculaires
elle permet d’atteindre un facteur de compaction de près recrutés pour la transcription d’un gène ou la traduction
de 400 fois pour faire tenir cette quantité d’ADN dans un d’un ARNm. Néanmoins, il ne s’agit que d’une description
3volume nucléaire de moins de 50 mm .qualitative de ces processus. Il est rare de voir évoquer
L’unité de base de la chromatine est le nucléosome, l’aspect quantitatif et dynamique de l’expression génique.
constitué de quatre types d’histones constitutifs (H2A, H2B, Pourtant, des questions simples et essentielles doivent être
H3 et H4), petites protéines basiques, formant un octa-posées : les partenaires sont-ils présents ? Au bon endroit ?
mère autour duquel s’enroulent environ 160 pb d’ADN. Au bon moment ? Quelle est la stœchiométrie du système ?
Cette structure est maintenue par des histones de type Le nombre de partenaires est-il suffsant ? (Guptasarma,
H1. D’autres protéines de nature non histone ainsi que 1995).
des ARN pourraient participer à la stabilité de ce complexe De plus la plupart des réactions biochimiques
cellunucléoprotéique. Au cours du cycle cellulaire, le niveau de laires font partie de réseaux, les produits de certaines
réaccompaction de la chromatine évolue du nucléoflament tions pouvant servir de substrat à d’autres réactions. Des
jusqu’au chromosome métaphasique hypercondensé, fuctuations peuvent ainsi déstabiliser le réseau et avoir un
notamment grâce à la présence d’histones H1 (Grigoryev impact sur la qualité du signal biologique.
et al., 2009).
Les différents niveaux de compaction de la
chroBruit structural : compartimentation matine sont caractérisés par un profl de modifcations
subcellulaire et dynamique post-traductionnelles au niveau des histones, mais aussi
par des modifcations covalentes de l’ADN. Ces change -chromatinienne
ments modifent l’affnité de l’ADN pour les histones ainsi
Contrairement aux procaryotes, les cellules euca- que le recrutement de facteurs de stabilisation et de
remoryotes sont des systèmes organisés et compartimentés par delage de la chromatine, facilitant ainsi le passage d’un état
des membranes internes qui délimitent des organelles. condensé à un état moins condensé.
Ces organelles accomplissent des fonctions particulières Les modifcations covalentes de l’ADN et post-tra -
qui nécessitent un environnement biochimique interne ductionnelles des histones sont dites « épigénétiques » par
différent du cytoplasme (réticulum endoplasmique, golgi, opposition aux mutations génétiques. Elles concernent
unimitochondries, lysosomes, noyau…). Cette différence quement les changements qui n’altèrent pas la séquence
d’environnement est exploitée pour produire un travail primaire de l’ADN. Elles consistent en majorité à l’ajout de
biochimique grâce à un gradient de molécules ou d’ions résidus acétyle, méthyle, phosphate… qui modifent l’aff -
(mitochondries, lysosomes…). nité entre l’ADN, les histones et des autres protéines
contriEn contrepartie, cette organisation nécessite de buant à la stabilité de la chromatine.
mettre en place des mécanismes de transport, souvent Malgré son apparente stabilité, la chromatine possède
actifs, entre compartiments. Ils permettent de maintenir le une dynamique interne intense. Les histones de base (H2A,
gradient, d’importer des substrats ou d’exporter des pro- H2B, H3 ou H4) ont un temps de résidence supérieur à la
duits et déchets biochimiques. plupart des autres protéines associées à l’ADN, pouvant
Dans le cadre de l’expression génique chez les euca- atteindre quelques dizaines de minutes à 1 heure (Kimura
ryotes, les échanges sont essentiels. Le matériel génétique et Cook, 2001). L’histone H1, qui se fxe à l’ADN entre les
est confné dans le noyau où a lieu la transcription, alors nucléosomes, possède une dynamique plus intense que les
que la traduction des ARNm se déroule à l’extérieur de ce histones « cœur » (H2A, H2B, H3 et H4), avec un temps de
compartiment. Une étape de transport des ARNm hors du résidence proche d’une minute (Lever et al., 2000 ; Misteli
noyau est donc nécessaire et peut ajouter de la variabilité et al., 2000).
en créant un délai entre la transcription et la traduction. Il La dynamique de la chromatine est ainsi intimement
en est de même pour le transport des substrats et enzymes liée à la nature des modifcations épigénétiques qu’elle
nécessaires à la transcription (ARN polymérase, nucléo- porte, mais surtout à leur réversibilité. Toutes les
moditides, cofacteurs ioniques…). Il est néanmoins diffcile de fcations sont catalysées par des enzymes particulières.
quantifer précisément l’impact de cette étape sur la varia - Toutefois, il existe dans la cellule des enzymes qui
catabilité observée et seules les modélisations informatiques lysent les réactions inverses de façon quasi immédiate
36 PARTIE I BIOLOGIE ET ENVIRONNEMENT DES CELLULES EN CULTURE (HAT/HDAC). Les modifcations épigénétiques sont donc aujourd’hui de nombreux synonymes dans la littérature
réversibles et ont un turnover important si bien que le sta- à cette notion de variabilité, tels que « stochasticité » ou
tut épigénétique d’une histone donnée est très dynamique. « bruit » de l’expression génique. Tous ces termes rappellent
Les marques épigénétiques considérées comme asso- que le niveau d’expression d’un gène donné n’est pas
ciées à l’activation de l’expression génique sont trouvées identique dans toutes les cellules d’une population, même
sur les histones ayant un turnover important. En effet, les d’origine clonale. Elle génère en conséquence une identité
marques épigénétiques en question affaiblissent les inter- cellulaire non génétique. La notion de « bruit », héritée de
actions entre les composants de la chromatine et facilitent l’anglo-saxon « noise », porte une connotation négative car
ainsi leur dissociation. Ainsi, l’accès à l’ADN de la machine- elle rappelle le « bruit » qui perturbe les signaux.
rie enzymatique qui catalyse la transcription est facilité par Durant cette période, on assiste à l’essor d’une autre
un turnover plus rapide du cycle association-dissociation discipline : la biologie des systèmes ou biologie
synthédes nucléosomes sur le promoteur du gène. Les marques tique. Grâce aux connaissances accumulées, notamment
inhibitrices ont un effet contraire ; elles renforcent les en biologie moléculaire, les recherches évoluent de la
inter actions et de cette façon empêchent la transcription caractérisation des gènes et de leur(s) produit(s) vers la
du gène. compréhension de leur régulation, de leurs interactions les
Cette observation permet de répondre à une des ques- uns avec les autres. De façon intéressante, la plupart des
tions fondamentales qui se posent lorsque l’expression articles théoriques traitant de ces réseaux géniques sont
d’un gène est étudiée. Plus que la nature de son promoteur, l’œuvre de biophysiciens modélisateurs.
la présence de séquences régulatrices ou le nombre de fac- La variabilité de l’expression génique a été mise en
teurs de transcription, c’est l’accessibilité de ces séquences évidence pour la première fois dans un article paru en 2002
aux facteurs de transcription qui est primordiale. Il est sou- (Elowitz et al., 2002). Dans cet article, les auteurs défnissent
vent fait mention de la spécifcité de certains facteurs de deux origines aux fuctuations de l’expression génique :
transcription, mais comment atteindre une séquence spé- intrinsèque et extrinsèque. L’infuence de ces deux compo -
cifque d’ADN lorsqu’elle est inaccessible ? santes est analysée de façon mathématique dans un second
On peut aisément imaginer que l’instabilité des article la même année (Swain et al., 2002). Cette approche
inter actions histone/ADN ainsi que celle des protéines s’y a été utilisée sur des cellules eucaryotes montrant un
phéfxant va potentiellement augmenter la probabilité d’ex - nomène similaire d’hétérogénéité (fgure 3-3 )
(Neildezpression d’un gène en facilitant temporairement et spon- Nguyen et al., 2008 ; Corre et al., en préparation).
tanément l’accès à l’ADN (Li et al., 2005). Le modèle de la Le bruit moléculaire est donc une source importante
décompaction spontanée et dynamique de la chromatine de fuctuations intrinsèques, qui est lié au nombre de par -
explique le fait qu’il existe dans chaque cellule, des épi- tenaires mais aussi à leur dynamique, rendant les réactions
sodes de transcription que l’on qualife « d’illégitimes ». biochimiques hautement probabilistes.
Ces événements concernent tous les gènes, particulière- De nombreux aspects quantitatifs, qualitatifs, spatiaux
ment ceux qui ne sont a priori pas liés au type cellulaire et temporels de ce processus ont été révélés. Nous savons
considéré, d’où leur caractère illégitime (Chelly et al., maintenant que l’expression d’un gène est conditionnée
1988 ; Chelly et al., 1989 ; Fonknechten et al., 1992). Ainsi, par son accessibilité à la machinerie de transcription,
elleles gènes qui se trouvent dans un environnement chroma- même dépendante de réactions complexes permettant le
tinien compact conservent toujours une probabilité certes remodelage de la chromatine. Elle est aussi régulée par la
faible de transcription. mobilité des différents partenaires du complexe de
transL’équilibre entre les différentes marques épigéné- cription, qu’il s’agisse de simple diffusion passive ou de
tiques va donc conditionner l’état d’activité transcription- transport actif entre compartiments cellulaires et
subcellunelle au locus concerné. En fonction de sa localisation laires (Smolen et al., 1999).
sur le génome, une séquence d’ADN peut donc se trouver Il est maintenant reconnu que le nombre d’ARNm à
dans une région dynamique ou dans une région stable. un instant donné dans une cellule peut être très faible, de
La dynamique de la chromatine joue par conséquent un l’ordre de 5 à 10 molécules (Velculescu et al., 1997 ; Holland,
rôle important dans la régulation de l’expression génique 2002 ; Ghaemmaghami et al., 2003). Plus important encore,
et introduit un élément d’incertitude caractérisé par une le nombre de copies d’un gène est limité à deux pour la
probabilité. plupart d’entre eux et, souvent, un seul allèle est
transcriptionnellement actif. Sur la base de cet aspect quantitatif,
les réactions biochimiques ont une propriété « bruitée » Stochasticité expression génique
intrinsèque qui est susceptible d’être une source de
variaLa nature aléatoire de l’expression génique et du bilité de l’expression génique.
fonctionnement cellulaire a été théorisée dans les années La probabilité d’assemblage d’un complexe de
trans1980 (Kupiec, 1983). Il aura fallu attendre les années 2000 cription est alors infuencée par la diffusion des parte -
pour qu’elle soit reconnue par la communauté scientifque naires, leur disponibilité et leur nombre (Greive et von
et commence à faire l’objet d’études spécifques. Il existe Hippel, 2005). L’expression génique étant un processus
chApitre 3 VARIABILITÉ NON GÉNÉTIQUE DANS LES CULTURES CELLULAIRES 37