FACULTÉ DES SCIENCES DE LA VIE

Alexandre Noiriel

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
Université Louis Pasteur Strasbourg I THÈSE présentée à la FACULTÉ DES SCIENCES DE LA VIE pour obtenir le titre de DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR Domaine : Biologie Moléculaire et Biochimie Végétale par Alexandre NOIRIEL Étude d'une famille de gènes d'Arabidopsis thaliana homologues de la lécithine cholestérol acyltransférase humaine. Caractérisation d'une nouvelle phospholipase A1 et étude d'une stérol acyltransferase Soutenue le 2 juillet 2004 devant la Commission d'examen : M Pierre BENVENISTE Directeur de thèse M Francis KARST Rapporteur interne M Alain PUGIN Rapporteur externe M Sten STYMNE Examinateur M Alain ZACHOWSKI Rapporteur externe

• géranyle géranyle diphosphate


• famille des acat


• conséquences marquées de l'activité enzymatique sur le métabolisme lipidique de la levure


• tentatives de modification de la quantit é d'esters de stérols par surexpression


• gène


• lcat humaine

Sujets

• Benveniste
• Louis Pasteur University
• Gérard Noiriel
• Schaller
• François Rabelais

Informations

• Publié par: profil-zyak-2012
• Publié le: 01 juillet 2004
• Nombre de lectures: 129
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 3 Mo

Extrait

Université Louis Pasteur Strasbourg I THÈSE présentée à la FACULTÉ DES SCIENCES DE LA VIE pour obtenir le titre de DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR Domaine : Biologie Moléculaire et Biochimie Végétale par Alexandre NOIRIEL Étude d’une famille de gènes d’ Arabidopsis thaliana homologues de la lécithine cholestérol acyltransférase humaine. Caractérisation d’une nouvelle phospholipase A1 et étude d’une stérol acyltransferase Soutenue le2 juillet 2004devant la Commission d’examen :  M Pierre BENVENISTE Directeur de thèse  M Francis KARST Rapporteur interne  M Alain PUGIN Rapporteur externe  M Sten STYMNE Examinateur  M Alain ZACHOWSKI Rapporteur externe

Je tiens à exprimer ma reconnaissance et mes remerciements à Monsieur Pierre Benveniste pour m’avoir accueilli dans son laboratoire et qui m’a ainsi permis de réaliser ce travail de thèse Messieurs Karst, Pugin, Stymne et Zachowski pour avoir accepté de juger ce travail Pierrette Bouvier-Navé et Hubert Schaller qui ont guidé mes recherches Jean-Luc Souciet, Claudine Bleykasten-Grosshans et Joseph Schacherer pour leurs conseils avisés concernant la levure Annie Hoeft, Màrta Ramel et Monique Schmitz qui m’ont assisté ainsi qu’à toute l’équipe du laboratoire. Enfin, une pensée particulière à toutes celles et tout ceux qui m’ont supporté (dans les deux sens du terme) durant ces années…

Sciences sans conscience n’est que ruine de l’âme. François Rabelais Celui qui ne connaît pas l'histoire est condamné à la revivre. Karl Marx La célébrité m'a apporté un gros avantage : les femmes qui me disent non sont plus belles qu'autrefois. Woody Allen

Thématique de la thèse

 La quantité de stérols libres est extrêmement régulée dans les membranes. Un moyen utilisé par les plantes pour réguler la teneur en stérols libres est d’estérifier ces stérols excédentaires et de les compartimenter dans des vésicules extramembranaires. L’enzyme qui estérifie les stérols, la stérol acyltransférase, joue donc un rôle majeur dans cette régulation.  Si de nombreux travaux biochimiques ont été consacrés à cette enzyme, le gène (ou les gènes) codant pour la SAT restaient inconnus. Par analogie avec des SAT préalablement caractérisées chez d’autres organismes, Champignons et Mammifères notamment, la SAT végétale pouvait appartenir à la famille des ACAT ou des LCAT. Le séquençage systématique du génome d’A. thalianaa permis de mettre en évidence plusieurs gènes homologues aux ACAT ou aux LCAT. Dans le génome d’A. thaliana,la seule protéine apparentée aux ACAT n’estérifie pas les stérols mais le diacylglycérol pour former un triacyglycérol, cette protéine n’était donc pas la SAT recherchée. Les 4 gènes d’A. thaliana homologues à la LCAT humaine étaient donc des candidats privilégiés pour coder une SAT végétale. Ces 4 gènes AtLCAT1, AtLCAT2, AtLCAT3 et AtLCAT4donc été exprimés ont inlevuro et/ouinplanta dans le but de caractériser une SAT végétale.  Un premier chapitre est consacré à l’étude deAtLCAT3dont nous avons montré qu’elle code une phospholipase A1, nous verrons la caractérisation biochimique de cette enzyme à la fonction inattendue, par expression dans la levure. Nous étudierons également les conséquences marquées de l’activité enzymatique sur le métabolisme lipidique de la levure.  Le second chapitre est consacré à l’étude deAtLCAT2qui code une stérol acyltransférase végétale. Nous présenterons les conséquences de la surexpression et de la mutation de cette protéine sur la quantité d’esters de stérolsin planta. Nous étudierons aussi le comportement de ces plantes cultivées dans des conditions où le métabolisme des esters de stérols est affecté.  Enfin le dernier chapitre regroupe les résultats obtenus lors de l’étude deAtLCAT1et AtLCAT4,que les tentatives de modification de la quantité d’esters de stérols par ainsi surexpression d’une SAT fongique. Un essai de clonage de la SAT végétale par complémentation d’un mutant de levure sera également présenté.

Liste des abréviations acylCoA cholestérol acyltransférase acide désoxyribonucléique acide désoxyribonucléique complémentaire acide gras acide gras libre acide ribonucléique acide ribonucléique messager adénosine triphosphate bromure d’éthidium sérum albumine bovine cycle seuil coenzyme A diméthylsulfoxyde désoxyribonucléotide triphosphate densité optique dithioérythritol éthylène diamine tétraacétate diphosphate de farnésyle glycéraldéhyde 3-phosphate géranyle géranyle diphosphate milieu de germination heure lipoprotéine de forte densité 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme A 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme A réductase diphosphate d’isopentényle Kilo paire de bases Kilo Dalton Knock-out

ACAT ADN ADNc AG AG ARN ARNm ATP BET BSA Ct CoA DMSO dNTP D.O. DTE EDTA FPP G3P GGPP GM h HDL HMG CoA HMGR IPP Kb KD KO

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L LB LCAT LDL LPC ORF pb PC PCR RE RNAse

rpm s SAT SDS TAE TAG TE Tris UV wt X-Gal

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litre milieu de Luria Bertani lécithine cholestérol acyltransférase lipoprotéine de faible densité lysophosphatidylcholine phase ouverte de lecture paire de bases phosphatidylcholine réaction de polymérisation en chaîne réticulum endoplasmique ribonucléase

rotation par minute seconde stérol acyltransférase dodécyl sulfate de sodium tampon tris acétate EDTA triacylglycérol tampon tris EDTA tris-hydroxyméthyl-aminométhane ultra-violet wild-type (« sauvage ») 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranoside

Liste des figures et tableaux : Page Figure 1: Numérotation du squelette carboné des stérols d’après la nomenclature1  I.U.P.A.C. Figure 2: Structure du noyau hopane et exemple d’hopanoïde.1 Figure 3: Structure des principaux stérols des eucaryotes.2 Figure 4: Rôle des stérols dans la structuration des membranes plasmiques2 Figure 5: Synthèse de l’IPP via la voie MEP5 Figure 6: Tronc commun de la biosynthèse des stérols6 Figure 7: Schéma de biosynthèse des stérols à partir de l’époxyde de squalène6 Figure 8: Métabolisme des stérols7 Figure 9: Structure d’une lipoprotéine8 Figure 10: Homéostasie du cholestérol chez les Mammifères9 Figure 11: Accumulation des esters de stérols dans les stérolosomes12 Figure 12: Réaction d’estérification du cholestérol catalysée par acylCoA cholestérol14  acyltransférases (ACAT) et les lécithine cholestérol acyltransférases  (LCAT) Figure 13: Pourcentage d'identité entre les séquences protéiques des LCAT-like20 Figure 14: Arbre phylogénétique reliant des protéines apparentées aux LCAT21 Figure 15: Alignement entre les séquences de HsLCAT et des 4 LCAT-like22  d’Arabidopsisthaliana Figure 16: Les différents types de phospholipases, sites d’hydrolyse et produits23  formés Figure 17: Dosage des lipides neutres de levures Sc059 transformées25  pYeDP60-AtLCAT3 Figure 18: Alignement de séquences nucléotidiques entreAtLCAT3et un clone de26  tabac q8487 décrit comme un facteur de transcription chez les plantes

Figure 19: Dosage des TAG de mutants de levures, affectés dans la biosynthèse28  des TAG, transformés pYeDP60-AtLCAT3 Figure 20: Détermination par chromatographie gazeuse de la composition en acides29  gras des triglycérides de levures Sc062 transformées pYeDP60-AtLCAT3 Figure 21: Western-blot des protéines des fraction microsomales et du surnageant30  100 000g de levures Sc062 transformées pYeDP60-AtLCAT3-Flag Figure 22: Dosage par chromatographie en phase gazeuse des acides gras libérés dans32  les fractions acides gras libres (AGL) et lysophosphatidylcholine (LPC)  après incubation de 1-myritoyl, 2-oleyl phosphatidylcholine. Figure 23: Pourcentage de la radioactivité libérée par AtLCAT3 dans les fractions32  acides gras libres (AGL) et lysophosphatidylcholine (lysoPC) après  incubation de diverses phosphatidylcholines radiomarquées Figure 24: Détermination de la température optimale de AtLCAT3 : mesure de33  l’activité spécifique phospholipase A1 en fonction de la température. Figure 25: Alignement de séquences peptidiques conservées dans la famille des34  LCAT animales et des LCAT-like végétales Figure 26: Mutation d’acides aminés conservés de AtLCAT335 Figure 27: Détermination de la quantité et de la composition des principaux39  métabolites lipidiques de la levure Sc062 transformée pYeDP60-AtLCAT3 Figure 28: Chromatogramme des méthyl-esters d'acides gras libres de la levure Sc06240  transformée pYeDP60-AtLCAT3 Figure 29: Incorporation de 14C-acide oléique dans différentes molécules lipidiques41  dans des levures transformées pYeDP60-AtLCAT3. Figure 30: Mesure des activité G3PAT et LPCAT dans des levures Sc06243  transformées pYeDP60-AtLCAT3quantifiées par la mesure de la PC  synthétisée Figure 31: Détermination de l’activité DGAT en fonction de la concentration44  d’acylCoA dans les levures Sc062 transformées pYeDP60-AtLCAT3 Figure 32: Corrélation entre l’accumulation de TAG et activité phospholipase A144  dans la levure transformée pYeDP60-AtLCAT3 Figure 33: Mesure de l’activité phospholipase et de la quantité de TAG de45  levures Sc062 transformées pVt102U-NtLCAT3 Figure 34: Dosage des stérols libres et estérifiés de levure Sc062 transformée46  pYeDP60-AtLCAT3

Figure 35: Voies de biosynthèse des principales classes de lipides47 Figure 36: Récapitulatif des principales enzymes de la biosynthèse des lipides chez47  la levure Figure 37: Expression relative des gènes de la synthèse des lipides chez la levure47  Sc062 pYeDP60-AtLCAT3mesurée par PCRq Figure 38: Observation microscopiques de levures transformées pYeDP60-AtLCAT348 Figure 39: Mouvements des acides gras entre les principaux pools de lipides chez50  la levure Sc062 transformée pYeDP60-AtLCAT3 Figure 40: Mesure de l’expression du transgène 35S::AtLCAT3, de la quantité d’esters52  de stérols et de TAG dans des transformants primaires de tabac. Figure 41: Mesure de l’activité spécifique phospholipase A dans les microsomes de53  feuillesdes transformants primaires de tabac 35S::AtLCAT3. Figure 42: Mesure de l’expression du transgène 35S::AtLCAT3dans des transformants53  de tabac de génération T2 par PCR quantitative. Figure 43: Mesure de différentes activités acylhydrolases dans les transformants de54  tabac 35::AtLCAT3de génération T2 Figure 44: Détermination de la cinétique d’expression de AtLCAT3 dans différentes56  conditions de stress physiologique d’Arabidopsisthaliana. Figure 45: Dosage des lipides neutres de levures Sc059 transformées64  pYeDP60-MtLCAT2 Figure 46: Pourcentage de stimulation de la formation d’esters de stérols en fonction66  des stérols libres incubés Figure 47: Analyse d’Arabidopsis transformés 35S ::AtLCAT268 Figure 48: Quantification des stérols libres et esters d’Arabidopsis transformés70  35S::AtLCAT2cultivés en milieu liquide Figure 49: Composition stérolique des fractions stérols libres et esters d’Arabidopsis70  transformés 35S::AtLCAT2cultivés en milieu liquide Figure 50: Quantification des stérols libres et esters d’Arabidopsis transformés71  35S::AtLCAT2cultivés en serre Figure 51: Composition stérolique de la fraction esters de stérols d’Arabidopsis71  transformés 35S::AtLCAT2cultivés en serre Figure 52: Quantification des stérols libres et esters d’Arabidopsistransformés72  35S::AtLCAT2cultivés sur milieu callogène

Figure 53: Composition stérolique des fractions stérols libres et esters73  d’Arabidopsistransformés 35S::AtLCAT2cultivés sur milieu callogène Figure 54: Phénotype d’Arabidopsis transformés 35S::AtLCAT2cultivés en milieu74  liquide durant 15 jours en présence de différentes concentration de  mévalolactone. Figure 55: Description des lignées de mutants T-DNA dans le gèneAtLCAT278 Figure 56: Chromatogrammes de la fraction esters de stérols (saponifiés et acétylés)79  extraite de mutant d’insertion T-DNA dansAtLCAT2. Figure 57: Quantification des stérols libres et esters de mutantAtLCAT2cultivés80  en milieu liquide Figure 58: Composition stérolique de la fraction esters de stérols de mutants80 AtLCAT2cultivés en milieu liquide Figure 59: Phénotype d’ArabidopsismutantsAtLCAT2cultivés en milieu liquide82  durant 15 jours en présence de mévalolactone 5mM. Figure 60: Phénotype d’ArabidopsismutantsAtLCAT2cultivés en milieu liquide81  durant 15 jours en présence de différentes concentrations de mévalolactone. Figure 61: Phénotype d’Arabidopsismutants AtLCAT2 cultivés sur milieu solide82  durant 3 semaines en présence de mévalolactone 5mM. Figure 62: Hypothèse sur la régulation de l’estérification des stérols chez87 Arabidopsisen présence de mévalolactone (MVL) Figure 63: Analyse d’Arabidopsistransformés 35S::AtLCAT191 Figure 64: Analyse de tabac transformés 35S ::AtLCAT1cultivés sur milieu92  callogène Figure 65: Quantité de stérols libres et d’esters de stérols dans des transformants93  primaires d’Arabidopsisécotype WS transformé 35S::AtLCAT1 Figure 66: Dosage des stérols de transformants secondaires d’Arabidopsisécotype94  WS transformé 35S::AtLCAT1 Figure 67: Dosage des stérols de tabac transformés 35S::AtLCAT1cultivés sur95  milieu callogène Figure 68: Description de la lignée EQY127 contenant une insertion T-DNA96  dans le gèneAtLCAT1 Figure 69: Criblage d’un mutant T-DNA homozygote par PCR97