Atomic force microscopy of biomimetic systems [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Matthias Janke

Matthias Janke

Sujets

• Physik
• Biologie

Informations

• Publié par: johannes_gutenberg-universitat_mainz
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 27
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 5 Mo

Extrait

 
 
 
Dissertation  
zur Erlangung des Grades 
“Doktor der Naturwissenschaften” 
 
 
am Fachbereich 
Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften 
der Johannes Gutenberg‐Universität Mainz 
 
 
 
 
vorgelegt von 
Matthias Janke 
geboren in Backnang 
 
 
Mainz, 2008 
Dekan: Prof. Dr. W. Hofmeister 
Erster Gutachter: Prof. Dr. A. Janshoff 
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. H.‐J. Butt 
 
Tag der mündlichen Prüfung: 08.05.2008 
 
 
 
Abstract 
This thesis was driven by the ambition to create suitable model systems that mimic 
complex processes in nature, like intramolecular transitions, such as unfolding and 
refolding of proteins, or intermolecular interactions between different cell compo‐
nents. Novel biophysical approaches were adopted by employing atomic  force  mi‐
croscopy AFM; as the main measurement technique due to its bro ad  diversity. 
Thus,  high‐resolution  imaging,  adhesion  measurements,  and  single‐molecule  force 
distance experiments were performed on the verge of the instrumental capabilities. 
As first objective, the interaction between plasma membrane and cytoskeleton, me‐
diated by the linker protein ezrin, was pursued. Therefore, the adsorption process 
and the lateral organization of ezrin on PIP  containing solid‐supported membranes 2
were characterized and quantified as a fundament for the establishment  of  a  bio‐
mimetic model system. As second component of the model system, actin filaments 
were coated on functionalized colloidal probes attached on cantilevers,  serving  as 
sensor elements. The zealous endeavor of creating this complex biomimetic system 
was rewarded by successful investigation of the activation process of ezrin. As a re‐
sult, it can be stated that ezrin is activated by solely binding to PIP  without any fur‐2
ther stimulating agents. Additional cofactors may stabilize and prolong the active 
conformation but are not essentially required for triggering ezrin’s transformation 
into an active conformation.  
In the second project, single‐molecule force distance experiments were performed 
on bis‐loop tetra‐urea calix4ar ene‐catenanes with different loading rates increase 
in  force  per  second.  These  macromolecules  were  specifically  designed  to  investi‐
gate the rupture and rejoining mechanism of hydrogen bonds under external load. 
The entangled loops of capsule‐like molecules locked the unbound state of intramo‐
lecular hydrogen bonds mechanically, rendering a rebinding observable on the ex‐
perimental time scale. In conjunction with Molecular Dynamics simulations, a three‐
well potential of the bond rupture process was established and all kinetically rele‐
vant parameters of the experiments were determined by means of Monte Carlo si‐
mulations and stochastic modeling.  
In summary, it can be stated that atomic force microscopy is an invaluable tool to 
scrutinize relevant processes in nature, such as investigating activation mechanisms 
in proteins, as shown by analysis of the interaction between F‐actin  and  ezrin,  as 
well as exploring fundamental properties of single hydrogen bon ds  that  are  of 
paramount interest for the compl ete  understanding  of  complex  supramolecular 
structures.  
      
 
 
TABLE OF CONTENTS 
1  INTRODUCTION  1 
2  ATOMIC FORCE MICROSCOPY  4 
2.1  IMAGING SURFACES  5 
CONTACT MODE  5 
TAPPING MODE : INTERMITTENT CONTACT MODE OR AC MODE  6 
2.2  FORCE DISTANCE MEASUREMENTS  8 
CANTILEVER CALIBRATION   9 
COLLOIDAL PROBE MICROSCOPY CPM  11 
HYDRODYNAMIC IMPACT ON THE APPROACH OF A SPHERE TO A SURFACE IN  FLUIDS  12 
3  EXPERIMENTAL PROCEDURES  15 
3.1  SUBSTRATES  15 
OXIDIZED SILICON WAFERS  16 
ULTRAFLAT : MICA‐STRIPPED;  GOLD  17 
3.2  MATERIALS AND SAMPLE PREPARATION: EZRIN‐ACTIN EXPERIMENTS  18 
PROTEIN PURIFICATION  18 
PREPARATION OF SOLID‐SUPPORTED MEMBRANES AND EZRIN ADSORPTION   18 
ELLIPSOMETRY  19 
ATOMIC FORCE MICROSCOPY – IMAGING OF THE EZRIN ADSORPTION  19 
ACTIN POLYMERIZATION  19 
FLUORESCENCE MICROSCOPY  20 
COLLOIDAL PROBE MICROSCOPY: CANTILEVER‐BEAD PREPARATION AND FUNCTIONALIZATION   20 
ATOMIC FORCE MICROSCOPY / COLLOIDAL PROBE MICROSCOPY CPM  20 
3.3  MATERIALS AND SAMPLE PREPARATION: CALIXARENE EXPERIMENTS  21 
SYNTHESIS OVERVIEW  21 
IMAGING OF SELF‐ASSEMBLED BIS‐TETRA‐UREA CALIX4 ARENES  22 
SINGLE MOLECULE FORCE DISTANCE EXPERIMENTS  23 
   
 
 TABLE OF CONTENTS 
4  INTERACTION OF EZRIN WITH PIP  CONTAINING MEMBRANES AND  F‐ACTIN  24 2
4.1  FUNDAMENTALS  24 
THE LIPID PHOSPHATIDYLINOSITOL 4,5‐BISPHOSPHATE PIP   24 2
EZRIN AND THE ERM‐PROTEIN FAMILY  25 
ACTIN: STRUCTURE AND FUNCTION  28 
4.2  EXPERIMENTAL RESULTS & DISCUSSION:  
ADSORPTION OF EZRIN ON SOLID‐SUPPORTED MEMBRANES SSM  30 
FORMATION OF SOLID‐SUPPORTED MEMBRANES  30 
COOPERATIVE ADSORPTION OF EZRIN ON PIP  CONTAINING MEMBRANES  32 2
REVERSIBILITY OF EZRIN ADSORPTION  36 
DISCUSSION  38 
ADSORPTION OF EZRIN ON DOGS NI‐NTA CONTAINING MEMBRANES  39 
4.3  EXPERIMENTAL RESULTS & DISCUSSION:  
INTERACTION BETWEEN MEMBRANE‐BOUND EZRIN AND ACTIN FILAMENTS  42 
INVESTIGATION OF F‐ACTIN BINDING TO EZRIN‐MONOLAYERS  
ON SSM BY EPIFLUORESCENCE MICROSCOPY  43 
FUNCTIONALIZATION OF THE CANTILEVER MICROSPHERES WITH F‐ACTIN  45 
ADHESION MEASUREMENTS PERFORMED BY COLLOIDAL PROBE MICROSCOPY   47 
ADHESION ANALYSIS  51 
DISCUSSION  53 
5  UNFOLDING AND REFOLDING OF NANOCAPSULES  
AS A NEW PATHWAY OF BIOMIMETIC MODELING  57 
5.1  CALIXARENES: PROPERTIES & FUNCTIONS  61 
5.2  EXPERIMENTAL RESULTS & DISCUSSION:  
IMAGING OF SELF‐ASSEMBLED BIS‐TETRA‐UREA CALIX4 ARENES  63 
5.3  SINGLE MOLECULE FORCE SPECTR