Biochemical non-equivalence of the DSL proteins DLL1 and DLL3 [Elektronische Ressource] / von Insa Geffers

Insa Geffers

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• Publié par: gottfried_wilhelm_leibniz_universitat_hannover
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 25
• Langue: English
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Extrait

Biochemical non-equivalence
of the DSL proteins DLL1 and DLL3
Von der naturwissenschaftlichen Fakultät
der Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover
zur Erlangung des Grades


DOKTORIN DER NATURWISSENSCHAFTEN
Dr. rer. nat.
genehmigte Dissertation
von
Dipl.-Biochem. Insa Geffers
geboren am 24.02.1976 in Wilhelmshaven


2008



Referent: Prof. Dr. Walter Müller
Korreferent: Prof. Dr. Achim Gossler
Tag der Promotion: 3. März 2008










Abstract
Abstract
The evolutionary conserved Notch signaling pathway mediates direct communication between
adjacent cells and plays a pivotal role in somite formation and patterning during
embryogenesis. The Notch ligands Dll1 and Dll3 are both essential for somitogenesis in
mammals. However, despite their largely overlapping expression domains in the presomitic
mesoderm of mouse embryos, Dll1 and Dll3 null mutant mice display strikingly different
somite defects. Additionally, the DLL1 and DLL3 proteins differ with respect to various
domains suggesting that both proteins are biochemically not equivalent and exert non-
redundant functions during somitogenesis.
In this study, it was demonstrated that DLL3 does not induce Notch signaling in
transactivation assays. Providing a ‘trivial’ explanation, the DLL3 protein does not localize to
the cell surface but accumulates inside the cell. Subcellular localization studies in the
presomitic mesoderm of mouse embryos revealed that endogenous DLL3 predominantly
localizes to the Golgi apparatus whereas endogenous DLL1 is expressed at the cell
membrane. In vitro analyses of cell surface presentation and subcellular localization of DLL1-
DLL3 chimeric ligands demonstrated that the transmembrane domain and juxtamembrane
sequences of DLL3 harbor recognition sequences that are responsible for Golgi retention of
the protein. Furthermore, the DSL domain of DLL1 appears to be necessary in order to direct
cell surface presentation. In combination with EGF-like repeats 1 and 2 and the
transmembrane and intracellular domain, the DSL domain of DLL1 seems sufficient to
activate Notch signaling as determined by transactivation assays. In addition, two conserved
amino acid motifs in the DSL domain of DLL1 that are not present in the divergent DSL
domain of DLL3, were shown to be necessary for efficient cell surface presentation and for
DLL1 function.
The analysis of presomitic mesoderm of Dll3 mutant pudgy embryos showed that the loss of
Dll3 has only a low impact on Notch activation suggesting that DLL3 does not exert
antagonistic but rather modulatory influence on Notch signaling.
As part of this study the Dll3 coding sequence was inserted into the Dll1 locus by targeted
recombination, thus exchanging the endogenous expression of Dll1 for that of Dll3. This
presented a pivotal prerequisite for the analysis of the functional non-equivalence of Dll1 and
Dll3 in vivo.
i Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der konservierte Notch-Signalweg vermittelt die Kommunikation zwischen benachbarten
Zellen und spielt eine Schlüsselrolle in der Somiten- und Musterbildung während der
Embryonalentwicklung. Die Notch-Liganden Dll1 und Dll3 sind beide unentbehrlich für eine
normale Somitenbildung in Säugetieren. Trotz der weitgehend überlappenden Expressions-
muster im präsomitischen Mesoderm von Mausembryonen, zeigen Mäuse mit Nullallelen von
Dll1 und Dll3 unterschiedliche Somitendefekte. Zusätzlich legen Unterschiede in der Protein-
struktur von DLL1 und DLL3 die Vermutung nahe, dass beide Faktoren biochemisch nicht
äquivalent sind und unterschiedliche Funktionen während der Somitenbildung übernehmen.
In dieser Studie wurde gezeigt, dass DLL3 kein echter Notch-Ligand ist, da es keine Notch-
Aktivierung auslöst. Dies ist darauf zurückzuführen, dass DLL3 nicht auf der Zelloberfläche
präsent ist, sondern intrazellulär akkumuliert. Die Analyse der subzellulären Lokalisierung
von DLL3 im präsomitischen Mesoderm von Mausembryonen zeigte, dass endogenes DLL3
im Gegensatz zu DLL1 überwiegend im Golgi-Netzwerk und nicht auf der Zelloberfläche
lokalisiert ist. Die Untersuchung von Dll1-Dll3-chimären Liganden im Hinblick auf
Zelloberflächenpräsentation und subzelluläre Lokalisierung der Proteine zeigte, dass die
Transmembrandomäne von DLL3 zusammen mit benachbarten Regionen Signalsequenzen
aufweist, die für das Zurückhalten des Proteins im Golgi-Apparat verantwortlich sind. Für
eine effiziente Oberflächenlokalisierung der chimären Liganden war die DSL-Domäne von
DLL1 zwingend erforderlich. Für das Transaktivierungspotential der chimären Liganden ist
die Präsenz des N-Terminus einschließlich der DSL-Domäne und der ersten beiden EGF-
ähnlichen Domänen zusammen mit der Transmembran- und intrazellulären Domäne von
DLL1 ausreichend. Weiterhin wurde gezeigt, dass zwei konservierte Aminosäuremotive in
der DSL-Domäne von DLL1, die in der DSL-Domäne von DLL3 fehlen, unerlässlich für die
korrekte Lokalisierung und Aktivatorfunktion von DLL1 sind. Die Analyse von präsomi-
tischem Mesoderm aus Dll3-mutanten Mausembryonen zeigte, dass der Verlust von DLL3
kaum Auswirkung auf das Ausmaß der Notch-Aktivierung hat. Diese Beobachtung legt nahe,
dass die Funktion von Dll3 einen eher modulatorischen als antagonistischen Einfluß auf die
Notch-Aktivierung während der Somitogenese ausübt. Als weiterer Teil dieser Studie wurde
die kodierende Sequenz von Dll3 in den Dll1 Locus der Maus eingebracht, um die endogene
Expression von Dll1 durch Dll3 zu ersetzen und so die Voraussetzung für die Analyse einer
möglichen funktionellen Redundanz von Dll1 und Dll3 in vivo zu schaffen.
ii
Key words
Dll1, Dll3, Notch signaling

Schlagworte
Dll1, Dll3, Notch Signalweg
iii
TABLE OF CONTENT
Abstract ......................................................................................................................................i
Zusammenfassung ....................................................................................................................ii
1 Introduction..........................................................................................................................1
1.1 Somitogenesis in mice..................................................................................................1
1.2 The Notch signaling pathway.......................................................................................4
1.3 Biochemistry of the canonical Notch signaling pathway.............................................5
1.4 Modulation of Notch signaling.....................................................................................8
1.4.1 Regulation of Notch ICD turnover and negative feedback loops
of Notch targets...............................................................................................9
1.4.2 Processes modulating Notch receptors and ligands .......................................9
1.5 Pathology of aberrant Notch signaling.......................................................................11
1.6 Components of the Notch signaling pathway.............................................................12
1.6.1 Notch receptors .............................................................................................12
1.6.2 Notch ligands ................................................................................................14
2 Aims of this study...............................................................................................................21
3 Material and Methods .......................................................................................................22
3.1 Material ......................................................................................................................22
3.1.1 Primers..........................................................................................................22
3.1.2 Synthetic DNA, Vectors and cDNAs..............................................................23
3.1.3 Media.............................................................................................................24
3.1.4 Cells...............................................................................................................25
3.1.5 Antibodies......................................................................................................26
3.1.6 Data bases.....................................................................................................27
3.1.7 Computer programs ......................................................................................28
3.2 Methods of molecular biology ...................................................................................29
3.2.1 Standard conditions and methods of molecular biology...............................29
3.2.2 Generation of expression constructs.............................................................29
3.2.3 Generation of the targeting construc