Characterization of the processivity of the fast fungal kinesin, NKin, from Neurospora crassa, on the level of single molecules [Elektronische Ressource] / von Stefan Lakämper

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• Publié par: gottfried_wilhelm_leibniz_universitat_hannover
• Publié le: 01 janvier 2003
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• Langue: English
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Extrait

Characterization of the processivity of the fast fungal kinesin,
NKin, from Neurospora crassa, on the level of single molecules













Vom dem Fachbereich Chemie
der Universität Hannover



zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
Dr.rer.nat.
genehmigte Dissertation
von




Dipl. Biochem. Stefan Lakämper
geboren am 02.02.1974, in Gütersloh

2003
















































Referent: Prof. Dr. Dietmar Manstein
1. Koreferent: Prof. Dr. Manfred Schliwa
2. Kont: Prof. Dr. Edgar Meyhöfer

Tag der Promotion: 12. Dezember 2003









Abstract

Molecular motors generate directed motion on all levels of organization in living organisms.
They transduce chemical energy from binding and hydrolysis of ATP to mechanical work and
produce movement along protein filaments. The dimeric motor kinesin is responsible for
driving long range anterograde transport of vesicles and small particles along microtubules in
the cell. The most prominent adaptation to this cellular function is the ability of single kinesin
molecules to move for µm-long distances along the microtubule, taking hundreds of 8 nm-
steps while producing forces of ~5pN. The chemo-mechanical processes underlying such
processive movement have been studied extensively in animal conventional kinesins. The
description and isolation of the fungal conventional kinesins, NKin from Neurospora crassa,
which moves considerably faster than its animal counterparts, has sparked intensive
investigations aiming at the dissection of this fast movement. As the non-processive motor
myosin generates comparably fast movement, it was of crucial importance to resolve whether
fast NKin movement is processive or non-processive. While several reports supported that
NKin is processive, it was necessary to confirm these findings with independent, direct
methods. Furthermore, unusual structural features of the neck domain of NKin suggested
unique opportunities to compare mechanisms possibly regulating processive movement.

Using TIRF-microscopy, the processive movement of single fluorescently labeled NKin
motors was confirmed by direct evidence. Furthermore, a quantitative comparison of the
processive movement revealed that NKin is able to move twice as processive as human
kinesin (HKin) while maintaining high gliding speeds. An electrostatic interaction between
the negatively charged flexible C-terminus of tubulin (E-hook) and the positively charged
neck of conventional kinesin is implicated in maintaining highly processive movement of
conventional kinesins. Removing the E-hook by partial proteolysis allowed to reveal that the
E-hook not only reduces the number of steps NKin can take during processive runs, but also
the speed of NKin during processive movement. However, the unusual properties of the neck
domain of NKin, above all the reduced charge as compared to animal kinesins, suggest
additional mechanisms determining processivity. Results from single molecule trapping
measurements presented here rule out an influence of the E-hook on the strong binding state
of NKin, which might have explained effects on processivity and speed.

In a short mutational study aimed at dissecting the increased speed of NKin motors, residues
in the neck-linker of HKin were substituted by lysines strongly conserved at homologous
positions in fast fungal kinesins. Initial gliding assays of these mutant motors, although highly
preliminary, show increased gliding speeds.

Keywords: kinesin; processivity; single molecule assay
1
Zusammenfassung

Gerichtete Bewegung wird auf allen Ebenen zellulärer Organisation durch Motormoleküle
erzeugt. Indem sie ATP binden und nachfolgend hydrolysieren, wandeln diese Proteine
chemische Energie in mechanische Arbeit um und bewerkstelligen so Fortbewegung und
Transportprozesse entlang von Strukturproteinen. Der dimerische Motor Kinesin ist für den
intrazellulären, anterograden Transport von Vesikeln und kleinen Protein-Partikeln entlang
von Mikrotubuli verantwortlich. Eine hervorstechende Anpassung an diese zelluläre Aufgabe
ist die Fähigkeit einzelner Motoren, sich mehrere µm entlang des Microtubulus zu bewegen,
indem mehrere hundert, 8 nm große Schritte ausgeführt werden während substantielle Kräfte
von ~5 pN ausgeübt werden können. Die Prozesse, die die Grundlage dieser prozessiven
Bewegung bilden, sind ausführlich an koventionellen tierischen Kinesinen untersucht worden.
Die Beschreibung und Isolation eines schnellen Pilz-Kinesins, NKin aus dem rosa
Brotschimmel Neurospora crassa, hat intensive Forschung angeregt, die darauf zielt, die
Erzeugung der schnelle Bewegung dieser Motoren zu verstehen. Da der nicht-prozessive
Motor Myosin ähnlich schnelle Bewegung von Aktin-Filamenten erzeugen kann, war es von
überragender Bedeutung, zu ermitteln, ob sich NKin prozessiv entlang von Microtubuli
bewegen kann. Obschon Hinweise auf Prozessivität von NKin veröffentlicht wurden, war es
notwendig, diese mit unabhängigen direkten Methoden zu bestätigen. Weiterhin legten
ungewöhnliche Eigenschaften der Hals-Domäne einzigartige Möglichkeiten nahe, Prozesse zu
untersuchen, die prozessive Bewegung regulieren könnten.

Durch Verwendung TIRF-Mikroskopie konnte die prozessive Bewegung von einzelnen,
fluoreszenzmarkierten NKin Molekülen eindeutig bestätigt werden. Weiterhin konnte durch
einen direkten Vergleich gezeigt werden, daß NKin in der Lage ist, unter Beibehaltung der
hohen Gleitgeschwindigkeit, doppelt so viele Schritte wie humanes Kinesin (HKin)
auszuführen. Die prozessive Bewegung tierischer Kinesine scheint durch eine Interaktion
zwischen dem negativ geladenen C-Terminus (E-hook) der Tubulin-Monomere des
Mikrotubulus´ und dem positv geladenen Hals bestimmt zu werden. Teilweiser enzymatischer
Verdau des Tubulins erlaubte es, den E-hook zu entfernen und so zu zeigen, daß der E-hook
nicht nur die Prozessivität sondern auch maßgeblich die Geschwindigkeit der prozessiven
Bewegung von NKin beeinflußt. Die ungewöhnlichen Eigenschaften, vor allem die in
Vergleich zu HKin stark reduzierte Ladung in der Hals-Domäne von NKin, deuten darauf hin,
daß zusätzliche Mechanismen Prozessivität und Geschwindigkeit von NKin beeinflussen.
Resultate von Kraftmessungen am Eizelmolkül, schließen aus, daß der E-hook einen Einfluß
auf die starke Bindung des Kopfes an den Mikrotubulus hat.

In einer kurze Studie, die darauf abzielte, die erhöhte Gleitgeschwingigkeit von NKin zu
untersuchen, wurden Aminosäuren im Neck-Linker von HKin durch Lysin-Reste ersetzt, die
in Pilz-Kinesinen stark konserviert sind. Obgleich die Ergebnisse nur sehr vorläufige
Schlussfolgerungen erlauben, zeigen erste Gleitassays eine erhöhte Gleitgeschwindigkeit.

Schlagworte: Kinesin, Prozessivität; Einzelmolekülassays
2
Table of contents
Abstract ___________________________________________________________________ 1
Zusammenfassung __ 2
Table of contents ___________________________________________________________ 3
Abbreviations ______ 5
Chapter I: Introduction ______________________________________________________ 6
Directed Motion is a criteria of life________________________________________________________ 6
Directed Motion is generated by motor molecules ____________________________________________ 6
The Eukaryotic Cytoskeleton________________________________________ 7
Linear Motor Molecules of the Eukaryotic Cytoskeleton _______________________________________ 7
Kinesin motors __________________ 8
Conventional Kinesin ______________ 8
Processivity of kinesin ____________ 9
Hand over hand-model of movement and the concept of alternating head catalysis__________________ 10
Strain communicates nucleotide states between the two heads__________________________________ 12
Crystal structure of dimeric kinesin ____________________________________ 13
Processivity requires two heads – KIF1A discussion _________________________________________ 15
Fast fungal kinesins________________________________________________ 16
Specific questions ______________________________________________________________ 16
Chapter II : Comparison of the processive movement of HKin and NKin in single molecule
fluorescence assays_________________________________________________________ 18
Introduction___________________________________________________________________ 18
RESULTS_____________________________________________________________________ 20
Multiple motor gliding assays___________________________________________________________ 20
Single