Die Bedeutung von microRNAs für die Funktion von Endothelzellen [Elektronische Ressource] / von Angelika Bonauer

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• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 33
• Langue: Deutsch
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Extrait

 
Die Bedeutung von microRNAs für die
Funktion von Endothelzellen

Dissertation zur Erlangung
des Doktorgrades der Naturwissenschaften



Vorgelegt beim Fachbereich Biowissenschaften
der Goethe Universität Frankfurt am Main



Von
Angelika Bonauer
aus Hilden im Rheinland





Frankfurt 2008






 
The role of microRNAs for endothelial
cell function

Dissertation zur Erlangung
des Doktorgrades der Naturwissenschaften



Vorgelegt beim Fachbereich Biowissenschaften
der Goethe Universität Frankfurt am Main



Von
Angelika Bonauer
aus Hilden im Rheinland





Frankfurt 2008













Vom Fachbereich Biowissenschaften der
Goethe Universität als Dissertation angenommen




Dekan: Professor Dr. Volker Müller

1. Gutachter: Professor Dr. Beatrix Süß
2. Gutachter: Professor Dr. Stefanie Dimmeler



Datum der Disputation: ................................








Danksagung

An dieser Stelle möchte ich allen danken, die mir mein Studium und die Beendigung
der Promotion ermöglichten.

Mein besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. Stefanie Dimmeler und Herrn Prof. Dr.
Andreas Zeiher für die Überlassung dieses interessanten, neuen Themas und den
ausgezeichneten Arbeitsbedingungen.

Die Begeisterung von Frau Prof. Dimmeler für dieses Thema und ihr unermüdlicher
Enthusiasmus haben maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen. Mit stets
neuen Herausforderungen hat sie viele Fortschritte, nicht nur im Rahmen des
Promotionsprozesses, angeregt und ermöglicht.

Dörte Scharner, Ariane Fischer, Dr. Alessia Orlandi und Guillaume Carmona danke
ich für ihre Freundschaft und Unterstützung in sämtlichen Lebenslagen und Phasen
dieser Arbeit und für die vielen nützlichen wissenschaftlichen Diskussionen.

Natalja Reinfeld danke ich für die intensive, praktische Unterstützung im letzten Jahr
meiner Promotion und für ihre stets sehr gute und zuverlässige Arbeit, die
maßgeblich zum Gelingen des Projektes beigetragen hat.

Desweiteren danke ich meinen gegenwärtigen und ehemaligen Laborkollegen
Natalja Reinfeld, Andrea Knau, Nicole Konecny, Carmen Döbele, Henrik Fox, David
Kaluza, Reinier Boon und Florian Diehl für das entspannte, freundschaftliche und
stets motivierende Arbeitsklima im Labor.

Ich danke dem „Task Force Team“ bestehend aus Ariane Fischer, Marion Muhly-
Reinholz und Tino Röxe für die gute Zusammenarbeit und ihren 150%igen Einsatz
im Rahmen von sämtlichen, mehr oder weniger langen Revisionen.

Der gesamten Molekularen Kardiologie danke ich für die sehr schönen letzten 3
Jahre, das sehr angenehme Arbeitsklima und dafür, die Arbeitsgruppe nicht nur als
Ansammlung von Mitarbeitern zu verstehen.


Meiner Familie danke ich für ihre Unterstützung und den privaten Rückhalt, den sie
mir während meiner gesamten Ausbildung geleistet haben.

Vor allem aber danke ich meinem Schatz Christoph dafür, daß er in allen Situationen
und Lebenslagen an mich geglaubt und mich unterstützt hat und dadurch
massgeblich zu meiner emotionalen und wissenschaflichen Entwicklung beigetragen
hat. Ohne ihn wäre ich vermutlich nicht dort angekommen, wo ich hier und heute
stehe.

 
 


Contents
1 INTRODUCTION .............................................................................................. 1
1.1 The circulatory system...................................................................................... 1
1.2 Vasculogenesis, angiogenesis and arteriogenesis ........................................... 1
1.2.1 Organization of the vascular system ............................................................. 3
1.2.2 The endothelium ........................................................................................... 4
1.2.3 Angiogenesis and disease ............................................................................ 5
1.3 MicroRNAs ....................................................................................................... 8
1.3.1 The diverse role of non-coding RNAs ........................................................... 8
1.3.2 MicroRNA history .......................................................................................... 9
1.3.3 Biogenesis .................................................................................................. 10
1.3.4 Target prediction and regulation.................................................................. 11
1.3.5 Regulation of microRNA activity .................................................................. 14
1.3.6 Role of Dicer and Drosha in endothelial cells .............................................. 15
1.3.7 Specific microRNAs involved in angiogenesis ............................................ 16
1.3.8 Role of microRNAs in diseases ................................................................... 18
1.3.9 miR-17-92 cluster ........................................................................................ 19
1.4 Aim of the study .............................................................................................. 22
2 MATERIAL AND METHODS ......................................................................... 23
2.1 Cell culture of HUVEC .................................................................................... 23
2.2 Cell culture of HEK293 ................................................................................... 23
2.3 Growth media ................................................................................................. 24
2.4 Transfection of oligonucleotides ..................................................................... 24
2.5 Transfection of pre-miRNA ............................................................................. 25
2.6 RNA isolation .................................................................................................. 26
2.7 RT-PCR and real time PCR ............................................................................ 26
2.8 Stem loop RT and quantitative PCR of miRNAs ............................................. 27
2.9 MicroRNA expression analysis ....................................................................... 28
2.10 MicroRNA array analysis ................................................................................ 29
i
2.11 Protein isolation .............................................................................................. 29
2.12 SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) .................................. 30
2.13 Western blot analysis ..................................................................................... 30
2.14 Immunocytochemistry for protein detection .................................................... 30
2.15 Immunofluorencence ...................................................................................... 32
2.16 Stimulation with VEGF.................................................................................... 32
2.17 with zVAD .................................................................................... 32
2.18 Tube forming assay ........................................................................................ 32
2.19 Spheroid-based angiogenesis assay .............................................................. 33
2.20 MTT viability assay ......................................................................................... 33
2.21 Cell-matrix adhesion ....................................................................................... 33
2.22 Migration assay .............................................................................................. 34
2.23 Cytokine and receptor array ........................................................................... 34
2.24 Flow cytometry analysis ................................................................................. 35
2.25 Proliferation assay .......................................................................................... 35
2.26 Annexin V staining of cardiomyocytes ............................................................ 35
2.27 Luciferase cloning and transfection ................................................................ 35
2.28 Plasmid preparation ....................................................................................... 36
2.29 In vivo Matrigel plug assay with transfected HUVEC ...................................... 36
2.30 Antagomirs ..................................................................................................... 37
2.31 In vivo matrigel experiments ........................................................................... 37
2.32 Murine ischemic hind limb model ........................................................