GABA induced Ca_1hn2_1hn+ signaling in rat hippocampal astrocytes [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Silke D. Meier

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• Publié par: heinrich-heine-universitat_dusseldorf
• Publié le: 01 janvier 2007
• Nombre de lectures: 22
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 13 Mo

Extrait

2+GABA-Induced Ca Signaling in Rat
Hippocampal Astrocytes
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakult¨at
der Heinrich-Heine-Universit¨at Dusseldorf¨
vorgelegt von
Silke D. Meier
aus Aalen
September 2007Aus dem Institut fur¨ Neurobiologie
der Heinrich-Heine-Universit¨at Dusseldorf¨
Gedruckt mit der Genehmigung der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultat¨ der
Heinrich-Heine-Universit¨at Duss¨ eldorf
Referentin: Prof. Dr. C. R. Rose
Koreferent: Prof. Dr. H.-W. Mulle¨ r
Koreferent: Prof. Dr. A. Reichenbach
Tag der mundlic¨ hen Prufung:¨ 16.01.2008Introductory Remarks
Part of my PhD work, carried out in the Institute of Physiology at the
LMU Munich and the Institute for Neurobiology at the HHU Du¨sseldorf,
has already been published (Meier et al., 2006) or has been illustrated in
manuscripts that are in revision (Bennay et al.) or have been submitted
(Kafitz et al.). Therefore, the present work is confined to the description of
2+my most recent study on ”GABA-induced Ca Transients in Hippocam-
pal Astrocytes”. A manuscript describing these results will be submitted
for publication in winter 2007. In addition, I included all reprints or sub-
mitted manuscripts in the appendix (page 122ff), where I also detail my
contributions to each publication.Abstract
GABA (γ-aminobutyric acid), the predominant inhibitory neurotransmit-
ter in the mature mammalian brain, is excitatory for neurons during early
development upon GABA receptor activation. In astrocytes, GABA in-A
2+duces intracellular Ca transients by activation of both, GABA andA
2+GABA receptors. GABA receptor-mediated [Ca ] increases are in-B B i
volved in neuron-glia interaction by potentiating inhibitory synaptic trans-
mission (Kang et al., 1998) and by causing heterosynaptic depression (Ser-
rano et al., 2006). Given that GABA receptors couple to G proteinsB i/o
2+ 2+in neurons and inhibit presynaptic Ca channels, the observed [Ca ] in-i
creaseinastrocytesisanunexpectedfinding. Hence, theaimsofthepresent
2+study were (1) to elucidate the mechanism of GABA-induced Ca tran-
sients inastrocytes and(2)toestablisha developmentalprofile of astrocytic
2+ 2+Ca responses. Tothisend, IperformedCa imagingwithFura-2incom-
bination with whole-cell patch-clamp recordings in acute rat hippocampal
slices. For the identification of astrocytes, I adapted a method which had
originallybeenintroducedfortheidentificationofcorticalastrocytesin vivo
(Nimmerjahn et al., 2004). Astrocytes were stained with the red fluorescent
dye sulforhodamine 101 (SR101). The specificity of SR101 for astrocytes
in acute hippocampal slices at young postnatal stages (P03 and P15) was
confirmed with electrophysiological recordings. Local pressure application
2+ofGABA(100ms,1mM)toSR101-positivecellsinducedintracellularCa
transients, which were mediated by both GABA and GABA receptors.A B
Muscimol, a specific GABA receptor agonist, depolarized astrocytes andA
2+ 2+resultedinCa influxthroughvoltage-gatedCa channels,confirmingear-
lier studies. This mechanism was the same throughout the developmental
periodinvestigated(P03andP15). GABA receptoractivation,incontrast,B
2+resulted in delayed Ca transients that were due to G-protein activation
2+ 2+andCa releasefromIP -sensitiveintracellularCa stores. Aninteraction3
ofGABA receptorswithmetabotropicglutamatereceptors,ashasbeende-B
scribedinthecerebellum(Hironoetal.,2001;Tabataetal.,2004),mightalso
be the case in hippocampal astrocytes. While GABA R-activation inducedA
2+Ca transients in 70-100% of astrocytes throughout development (P03 to
2+P33±1), GABA -R-mediated Ca signaling exhibited a clear developmen-B
2+tal profile. The amount of astrocytes responding with a [Ca ] increasei
upon GABA receptor-activation showed a bell-shaped distribution with aB
maximum of 60% of cells responding during the second postnatal week (P11
2+to P15). This developmental profile of GABA receptor-mediated CaB
transients suggests that astrocytes play a role during postnatal maturation
of the hippocampal network.Zusammenfassung
GABA (γ-Aminobuttersau¨ re), der bedeutendste inhibitorische Neurotrans-
mitter im adulten Gehirn, wirkt w¨ahrend fruher¨ Entwicklungsphasen
ub¨ er GABA -Rezeptoren exzitatorisch auf Neurone. In Astrozyten fu¨hrtA
sowohl die Aktivierung von GABA - als auch GABA -Rezeptoren zu einerA B
2+ 2+Erh¨ohung der intrazellul¨aren Kalziumkonzentration ([Ca ] ). Diese Ca -i
Transientenk¨onnenzurTransmitterfreisetzungfuh¨ ren, weshalbsiebeiGlia-
Neuron-Interaktionen eine Rolle spielen. Die Aktivierung von GABA -B
Rezeptoren in Astrozyten fu¨hrt zu heterosynaptischer Depression (Ser-
rano et al., 2006) sowie zur Potenzierung inhibitorischer Neurotransmis-
sion (Kang et al., 1998). Die durch GABA -Rezeptoraktivierung entste-B
2+henden [Ca ] -Erh¨ohungen in Astrozyten sind ungew¨ohnlich, da neu-i
ronale GABA -Rezeptoren an G -Proteine binden und in Neuronen al-B i/o
2+lenfalls eine [Ca ] -Erniedrigung hervorrufen. Die vorliegende Studie hattei
2+die Zielsetzung, den Mechanismus GABA-induzierter Ca -Signale in As-
2+trozyten des Hippokampus zu ergrun¨ den, und die entstehenden [Ca ] -i
Erh¨ohungen w¨ahrend der postnatalen Entwicklung zu charakterisieren. Hi-
erzu wurden Fluoreszensmessungen mit Fura-2 durchgefuh¨ rt, sowie elek-
trophysiologische Methoden angewendet. Fu¨r die Identifizierung von As-
trozyten wurde eine Methode modifiziert, welche urspru¨nglich fu¨r die Iden-
tifizierung von kortikalen Astrozyten in vivo eingefu¨hrt worden war (Nim-
merjahn et al., 2004): in akuten Hirnschnitten von 3 bis 33
Tage alten Ratten wurden durch F¨arbung mit Sulforhodamin 101 (SR101)
identifiziert und die Spezifit¨at von SR101 fu¨r Astrozyten mittels elektro-
physiologischer Charakterisierung best¨atigt. Lokale GABA-Applikationen
2+(100 ms, 100 M) l¨osten [Ca ] -Erh¨ohungen in Astrozyten aus, welchei
sowohl von GABA - als auch GABA -Rezeptoren vermittelt wurden.A B
GABA -Rezeptoraktivierung mit Muscimol depolarisierte Astrozyten undA
2+ 2+fu¨hrte zu einem Ca -Einstrom durch spannungsabh¨angige Ca -Kan¨ale.
Dieser Mechanismus blieb w¨ahrend der gesamten Entwicklung erhalten
2+und los¨ te in 70-100% der Astrozyten Ca -Transienten aus. GABA -B
Rezeptoraktivierung fu¨hrte zu G-Proteinaktivierung und IP -vermittelter3
2+Ca -Freisetzung aus intrazellul¨aren Speichern. Eine Interaktion zwischen
GABA -Rezeptoren und metabotropen Glutamatrezeptoren, wie im Zere-B
bellum beschrieben (Hirono et al., 2001; Tabata et al., 2004), konnte nicht
ausgeschlossenwerden. InteressanterweisebestandenbeiGABA -Rezeptor-B
2+abh¨angigen [Ca ] -Erhoh¨ ungen deutliche Unterschiede w¨ahrend der En-i
twicklung: Die Anzahl der reagierenden Zellen zeigte eine glockenf¨ormige
Verteilung, wobei w¨ahrend der zweiten postnatalen Woche (P11 bis P15)
ein Maximum von ca. 60% aller Astrozyten reagierte. Diese Ver¨anderungen
impliziereneineRollevonAstrozytenw¨ahrendderpostnatalenEntwicklung
neuronaler Netzwerke.
?Contents
Abbreviations 3
1 Introduction 7
1.1 Astrocytes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.1.1 Astrocytes - A Historical Perspective . . . . . . . . . . 7
1.1.2 The Problem of Astrocyte Identity . . . . . . . . . . . 9
2+1.1.3 Ca Signaling in Astrocytes . . . . . . . . . . . . . . 13
1.1.4 Neuron-Glia and Glia-Neuron Interaction . . . . . . . 17
1.2 The Hippocampus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.3 The Neurotransmitter GABA . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1.3.1 Effects of GABA on Neurons . . . . . . . . . . . . . . 24
1.3.2 Effects of on Astrocytes . . . . . . . . . . . . . 28
1.4 Aims of this Study . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2 Materials and Methods 34
2.1 Model Systems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.1.1 Primary Astrocyte Cultures . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.1.2 Acute Hippocampal Slices . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.2 Techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2+2.2.1 Ca Imaging Principles . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2+2.2.2 Ca Imaging in Acute Hippocampal Slices . . . . . . 44
2.2.3 Patch-Clamp Principles . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.2.4 Patcp in Acute Hippocampal Slices . . . . . . 47
2.3 Solutions and Chemicals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.3.1 Intracellular Solution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.3.2 Extracellular Solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.3.3 Chemicals and Stock Solutions . . . . . . . . . . . . . 50
2.4 Data Analysis and Illustrations . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
2.5 Statistical Analyses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
3 Results 53
3.1 Identification of Astrocytes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2+3.2 GABA-Induced Ca Signaling . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
2+3.3 Mechanism of GABA Receptor-Mediated [Ca ] Increases . 62A i
2+3.4 Mechanism of GABA Receptor-Mediated [Ca ]es . 67B i
2+3.4.1 Characteristics of Ca Responses . . . . . . . . . . . 67
1