Identification and characterization of Leishmania major UDP-sugar pyrophosphorylase and determination of its impact on UDP-galactose metabolism [Elektronische Ressource] / Sebastian Damerow

Sebastian Damerow

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• Publié par: gottfried_wilhelm_leibniz_universitat_hannover
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 14
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 4 Mo

Extrait

Identification and Characterization of
Leishmania major UDP-sugar
Pyrophosphorylase and Determination of its
Impact on UDP-galactose Metabolism


Von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover
zur Erlangung des Grades
Doktor der Naturwissenschaften
Dr. rer. nat


genehmigte Dissertation
von


Dipl.-Biochem. Sebastian Damerow
geboren am 4. März 1978 in Braunschweig


2010




















Referentin: Prof. Dr. Rita Gerardy-Schahn
Korreferentin: Prof. Dr. Françoise Routier

Tag der Promotion: 11. März 2010






meinen Großeltern
Herbert & Lucie
















„It is not the strongest species
that survives, nor the most intelligent,
but the one most responsive to change.”
Charles Darwin, 1809-1882Table of Contents
Table of Contents
Zusammenfassung……... ………………………………………………………………………………..…………... 5
Summary………. …………………………………………………………………………………………….………… 7
CHAPTER 1 – General Introduction………. ................................................................................................... 8
1.1 Leishmania, Leishmaniasis and Leishmanicidals…………....…………………………………….… 8
1.2 Biology & Pathobiology………………………………………………………………………………….. 9
1.2.1 Hosts………………………………………………………………………………………….……...... 10
1.2.2 Life Cycle…………………………………………………………………………………...………... 10
1.2.3 Genome……………………………………………………………………………………………… 12
1.3 Leishmania cell surface and roles in pathogenicity……………………………………..….……... 13
1.3.1 GPI-anchored Proteins…………………………………………………………………………….. 14
1.3.2 LPG…………………………………………………………………………………………………….. 14
1.3.3 GIPLs…………………………………………………………………………………………………… 16
1.3.4 PPGs…………………………………………………………………………………………………… 17
1.4 From Monosaccharide to Glycan……………………………………………………………………... 17
1.4.1 Glycan assembly…………………………………………………………………………………… 18
1.4.2 UDP-galactose metabolism……………………………………………………………………… 19
1.4.3 UDP-glucose pyrophosphorylase………………………………………………………………... 19
1.4.4 UDP-galactose pyrophosphorylase…………………………………………………………….. 20
1.4.5 UDP-sugar pyrophosphorylase……21
1.4.6 Glycosomes………………………………………………………………………………………….. 22
1.5 Objectives………………………………………………………………………………………………….. 24
CHAPTER 2 – Deletion of UDP-glucose Pyrophosphorylase Reveals a UDP-glucose
Independent UDP-galactose Salvage Pathway in Leishmania major …………………… 25
CHAPTER 3 – Leishmania major UDP-Sugar Pyrophosphorylase:
The Missing Link in Galactose Salvage?................................................................................ 40
CHAPTER 4 – Evaluating the Role of UDP-sugar Pyrophosphorylase in the Protozoan
Parasite Leishmania major………………………………………………………………………….59
CHAPTER 5 – General Discussion………………………………………………………………………………….. 73
5.1 UDP-glucose pyrophosphorylase deletion revealed a UDP-glucose independent
galactose salvage pathway in L. major…………………………………………………………….. 74
5.2 In vitro characteristics of a plant-like UDP-sugar pyrophosphorylase from L. major………... 74
5.3 UDP-galactose metabolism in L. major……………………………………………………………… 77
5.4 Importance of galactosylation for growth, virulence and viability in L. major…………....... 78
References…………………………………………………………………………………………………………….. 82
Abbreviations………………………………………………………………………………………………….………. 91
Curriculum Vitae……………………………………………………………………………………………….……... 93
Danksagung…………………………………………………………………………………………………………… 94

Zusammenfassung
Zusammenfassung
Leishmanien sind obligat parasitäre Protozoen aus der Familie der Trypanosomatidae, die vor allem in
tropischen und subtropischen Regionen, die weit verbreitete Krankheit Leishmaniose verursachen.
Umhüllt und geschützt von einer dichten Glykokalyx, widerstehen sie extrem lebensfeindlichen
Umwelteinflüssen. Die zelluläre Ummantelung des Parasiten besteht hauptsächlich aus den speziellen
Lipophosphoglycanen (LPGs), den mucin-artigen Proteophosphoglycanen (PPGs) und den
leichtkettigen Glycoinositolphospholipiden (GIPLs) und ist unentbehrlich für das Überleben im Darm
seines Vektors, der Sandfliege, und für die Infektiosität im Säugetier, seines Reservoirs.
Vor allem die Phosphoglycanstructuren von Leishmanien sind extrem galactosehaltig und setzen eine
spezialisierte, enzymatische Maschinerie voraus, um die hohen Ansprüche der UDP-Galactose-
Biosynthese zu decken. Die vor kurzem biochemisch charakterisierte L. major UDP-Glucose-
Pyrophosphorylase (UGP), die äußerst spezifisch Glucose-1-Phosphat mit UTP umsetzt und UDP-
Glucose und Pyrophosphat erzeugt, schien ein Schlüsselenzym der UDP-Galactose-Biosynthese zu
sein, da UDP-Galactose (UDP-Gal) entweder über Epimerisierung von UDP-Glucose (UDP-Glc) oder
durch Uridylyltransfer von UDP-Glc zu Galactose-1-Phosphat entstehen sollte (Leloir
Stoffwechselweg). Eine gezielte Gendeletion der UGP ( Δugp) zeigte allerdings nur geringfügigen
Einfluss auf die Phosphoglykanbiosynthese, wobei galactosehaltige GIPLs überhaupt nicht betroffen
waren. Dementsprechend war die Virulenz der Δugp Mutante nur moderat herabgesetzt. In Anbetracht
dieser Datenlage war anzunehmen, dass Leishmanien einen zweiten, UDP-Glucose unabhängigen
Stoffwechselweg nutzen können, was mit dem offensichtlichen Fehlen des Leloir-Stoffwechselwegs in
Leishmanien in Einklang war, da bisher kein verantwortliches Gen (von GALT) im Leishmanien
Genom annotiert werden konnte.
Es konnte jedoch ein aus Pflanzen stammendes Homolog der UDP-Zucker Pyrophosphorylase (USP)
in Leishmanien und einigen anderen Protisten identifiziert werden. Charakteristisch für diese neue
Klasse von Enzymen (EC 2.7.7.64) war ihre Fähigkeit, eine Bandbreite an Monosaccharid-1-
Phosphaten mit UTP zu aktivieren, wie Galactose-, Glucose-, Xylose-, L-Arabinose-, Galacturonsäure-
und Glucuronsäure-1-Phosphat, um daraus das jeweilige UDP-Monosaccharid und Pyrophosphat zu
formen. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Enzym eine hohe Affinität zur Bindung von UTP zeigt
und Galactose-1-Phosphat bevorzugt. Es zeigt einen gerichteten Bi-Bi Mechanismus, wobei zuerst
UTP binden muss, gefolgt vom jeweiligen Monosaccharid-1-Phosphat, wodurch sehr wahrscheinlich
die Erzeugung des UDP-Monosaccharids vorangetrieben wird. Somit stehen die in vitro gemessenen
Eigenschaften der USP in Einklang mit der postulierten Funktion der Galactoseverwertung. Damit
einhergehend ließ die erste Analyse einer L. major USP Gendeletionsmutante ( Δugp) eine verminderte
Galactosylierung der LPG Seitenketten vermuten.
Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass bereits die heterozygote Deletion der USP in der Δugp
Mutante ausreichend war, um die restliche LPG Expression dieses Stammes einzudämmen, und
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Zusammenfassung
demzufolge die Rolle der USP im UDP-Galactose Stoffwechsel verdeutlicht. Interessanterweise war
es trotz mehrmaliger Versuche nicht möglich eine Doppelmutante ( Δugp/ Δusp) zu generieren, was
darauf hindeutet, dass UDP-Gal und/oder UDP-Glc in L. major essentiell sind. Letztlich wurde die
subzelluläre Lokalisation der USP und einiger anderer an der UDP-Glc/UDP-Gal Biosynthese
beteiligter Enzyme aufgeklärt, wobei sich herausstellte, dass es bedeutende Unterschiede mit anderen
Trypanosomatiden gibt, die, anders als L. major, ihre UDP-Zucker in spezialisierten Organellen, den
Glycosomen, synthetisieren.
Schlagwörter: Galactose, UDP-Zucker Pyrophosphorylase, LPG, Leishmanien
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Summary
Summary
The protozoan parasites Leishmania spp., causing tropical and sub-tropical diseases called
leishmaniases, are surrounded by a thick glycocalyx that protects them from the hostile environments
in which they live. This cellular coat mainly consists of unique phosphoglycans, comprising the highly
abundant lipophosphoglycan (LPG) and mucin-like proteophosphoglycans (PPGs), as well as low
molecular weight glycoinositolphospholipids (GIPLs) and is indispensable for survival of the parasite
in the insect vector and for establishment of infection in mammals.
Leishmania phosphoglycans are extremely rich in galactose and require thus a specialized enzymatic
machinery to cover the high demand on UDP-galactose (UDP-Gal) for biosynthesis. The recently
biochemically characterized L. major UDP-glucose pyrophosphorylase (UGP), very specifically
utilizing glucose-1-phosphate and UTP to form UDP-Glucose (UDP-Glc) and pyrophosphate, was
supposed to be the key enzyme in UDP-Gal biosynthesis, either via subsequent epimerization of UDP-
Glc or by uridylyl transfer from UDP-Glc to galactose-1-phosphate. Targeted gene deletion of UGP
(Δugp), however, only partially affected the synthesis of the galactose rich phosphoglycans, while no
alteration in the abundant galactose-containing GIPLs was found. Consistent with these findings, Δugp
Leishmania virulence was only modestly affected. These data implied that Leishmania elaborates a
UDP-Glc independent sal