Identification of mouse cytomegalovirus factors that determine the tropism for epithelial cells and that induce morphological changes in infected cells [Elektronische Ressource] / von Sarah Sengstake

Sarah Sengstake

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• Publié le: 01 janvier 2009
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Extrait

Identification of Mouse Cytomegalovirus Factors that
Determine the Tropism for Epithelial Cells and that
Induce Morphological Changes in Infected Cells
Von der naturwissenschaftlichen Fakult¨at der
Gottfried Wilhelm Leibniz Universit¨at Hannover
zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER NATURWISSENSCHAFTEN
Dr. rer. nat.
genehmigte Dissertation
von
Dipl. Biol. Sarah Sengstake
geboren am 24.06.1978 in BremenReferent: Prof. Dr. Martin Messerle
Korreferent: Prof. Dr. Georg Herrler
Tag der Promotion: 2. Juni 20091 Abstract
Cytomegaloviruses (CMVs) infect different cell types, such as epithelial cells. Epithelial cells
are of particular importance for CMV infections, since they are exposed first to infectious virus
andtherefore arefirst targets forCMV.Cytomegaloviruses aretransmitted bybodilyfluids that
are secreted by epithelial cells. The broad cell tropism of CMV results from the acquisition
of cell tropism factors. Viral factors that determine the tropism of mouse CMV (MCMV) for
endothelial cells or macrophages have been described. Viral factors that determine the tropism
ofMCMVforepithelial cells, however, remain tobe identified. CMVs induce cell rounding that
causes the formation of characteristic plaques in the cell monolayer. This cytopathic effect is
only poorly characterised for MCMV.
Thepresent study aimed to identifyfactors ofMCMVthat determine the tropism forepithe-
lial cells and the induction of cell rounding during infection. To this end, a library of MCMV
mutants was generated. Genes were deleted that are dispensable for viral growth in fibrob-
lasts. Subsequently, the growth properties of the MCMV deletion mutants were investigated
in epithelial cells and fibroblasts. In parallel, the infected fibroblasts were screened for a loss
of cell rounding.
A virus mutant, lacking the gene region of m106 to m108, yielded strongly reduced titres
in epithelial cells compared to those of the wild type MCMV. By contrast similar titres were
measured in fibroblasts. Therefore, the presence of tropism factors for epithelial cells in this
region of the MCMV genome was assumed. The analysis of additional mutants excluded the
m106 gene and a stable intron RNA as potential epithelial tropism factors. The prevention
of potential m107 or m108 protein synthesis did not, however, inhibit the growth of the
respective mutants in epithelial cells. These results demonstrated that neither proteins nor
RNAaccountfortheimpairedgrowthofthe m106-m108deletionvirus. DNAsequences within
the m106-m108 region of the MCMV genome that are as yet undetermined possibly bind
epithelial cell-specific transcription factors and are a prerequisite for the productive infection
of epithelial cells. The analysis of the morphology of infected fibroblasts revealed that M25-
deficient MCMV mutants lost their ability to induce cell rounding. This could be restored
with inserting M25 in the mutant genome. M25 induced cell rounding in the absence of other
MCMV genes. The synthesis of M25 mRNAs and their translation into proteins correlated
with the kinetics of MCMV-induced cell rounding. In this study, M25 was identified as the
MCMV gene that is necessary for the induction of cell rounding.
mouse cytomegalovirus, cell tropism, cytopathic effect
1Zusammenfassung
Zytomegaloviren infizieren verschiedene Zelltypen, darunter auch Epithelzellen. Epithelzellen
spielen ein besondere Rolle f¨ur die Zytomegalovirus-Infektion. Sie sind vermutlich die ersten
Zellen, die infiziert werden und Zytomegaloviren werden in K¨orperfl¨ussigkeiten ¨ubertragen die
von Epithelzellen sezerniert werden. Der breite Zelltropismus der Zytomegaloviren beruht
auf dem Erwerb von Zelltropismusfaktoren. Bisher konnten f¨ur das murine Zytomegalovirus
(MCMV) Gene f¨ur den Endothelzell- und den Makrophagentropismus gefunden werden. Gene,
diedenEpithelzelltropismus desMCMVbestimmen, sindhingegenunerforscht. CMV-infizierte
Zellen runden sich ab was zu einem charakteristischen Plaque im Zellrasen f¨uhrt. Dieser zyto-
pathische Effekt ist f¨ur MCMV bisher wenig charakterisiert.
DasZielderArbeitwardieIdentifizierungvonviralenGenen,diedenEpithelzelltropismusdes
MCMV bestimmen und das Abrunden der Zellen w¨ahrend der MCMV-Infektion induzieren. Zu
diesem Zweck wurde eine Bibliothek vonMCMV-Mutanten hergestellt, in denen Gene deletiert
wurden, die nicht essentiell f¨ur das Wachstum in Fibroblasten sind. Die Deletionsmutanten
wurden anschliessend auf ihre Wachstumseigenschaften in Epithelzellen und Fibroblasten hin
¨uberpr¨uft. Die infizierten Fibroblasten wurden ausserdem auf einen Verlust der Zellabrundung
hin untersucht.
F¨ur das Virus, in dem die Gene m106-m108 deletiert sind, wurden stark reduzierte Titer in
Epithelzellen im Vergleich zu denen des Wild-Typ MCMV festgestellt. Die Titer der beiden
Viren in Fibroblasten waren hingegen vergleichbar. Daraus wurde geschlossen, dass in der
m106-m108 Gen-Region Faktoren f¨ur den Epithelzelltropismus kodiert sind. Mit Hilfe von
weiteren Deletionsmutanten konnten das m106-Gen und eine stabile Intron RNA als m¨ogliche
Epithelzelltropismusfaktoren ausgeschlossen werden. Auch die Verhinderung einer m¨oglichen
Synthese der m107- oder m108-Proteine schr¨ankte das Wachstum der Viren auf Epithelzellen
nicht ein. Diese Ergebnisse zeigten, dass weder Proteine noch RNA in der m106-m108 Region
des Genomes Tropismusfaktoren f¨ur Epithelzellen darstellen. M¨oglicherweise funktionieren
noch nicht identifizierte DNA-Sequenzen in dieser Region als Bindeelemente f¨ur epithelzell-
spezifische Transkriptionsfaktoren und sind somit eine Vorraussetzung f¨ur die effiziente Ver-
mehrung des MCMV in Epithelzellen.
¨Die Uberpr¨ufung der Morphologie der infizierten Fibroblasten zeigte, dass ein Fehlen des
M25-Gensim Virusgenom zu einem Verlust der Zellabrundung f¨uhrt. Diese Eigenschaft konnte
mit der Insertion des M25-Gens in die Mutante wiederhergestellt werden. Die Funktion des
M25-Gens war unabh¨angig von anderen MCMV-Genen. Die Synthese von M25 mRNAs und
deren Translation in Proteine korrelierte zeitlich mit dem MCMV-induzierten Zellabrunden.
Somit wurde M25 wurde als das MCMV-Gen identifiziert, welches f¨ur die Abrundung von
MCMV-infizierten Zellen notwendig ist.
Murines Zytomegalovirus, Zelltropismus, Zytopathischer Effekt
2Contents
1 Abstract 1
2 Introduction 5
2.1 The Biology of Cytomegaloviruses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.2 The Mouse Model of CMV Infection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.3 The Herpesvirus Life Cycle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.4 Organisation of the MCMV Genome . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.5 Cytomegalovirus Gene Expression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.6 Cytomegalovirus Cell Tropism . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.7 Cytomegalovirus-Induced Cell Rounding as a Cytopathic Effect . . . . . . . . . 17
2.8 Genetic Manipulation of Cytomegaloviruses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.9 Aims of the Study . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3 Material 25
3.1 Chemicals and Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.2 Cells and Bacteria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.3 Antibodies, Probes and Antibiotics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.4 BACs and Plasmids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.5 Laboratory Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4 Methods 31
4.1 Eukaryotic Cell Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.2 Mutagenesis of BACs using linear PCR Fragments . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.3 Culture of Bacteria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
4.4 Virological Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
4.5 DNA Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
4.6 RNA Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.7 Protein Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.8 Cell Tropism Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.9 Infection of Cells for the Screening of the Cellular Morphology . . . . . . . . . 46
4.10 Analysis of the Cellular Morphology after Transfection of the pIRES vectors . . 46
4.11 Bioinformatic Tools . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3Contents
5 Results 49
5.1 Generation of a Library of Mouse Cytomegalovirus Mutants . . . . . . . . . . 49
5.2 Searching for Viral Factors determining the Epithelial Cell Tropism of MCMV . 52
5.2.1 Establishment of a Cell Tropism Assay and Screening of a Library of
MCMV Mutants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
5.2.2 Analysis of the Δm106-m108 Virus Mutant . . . . . . . . . . . . . . . 58
5.2.3 Does the 7.2 kb Stable Intron RNA Function as a Tropism Factor for
Epithelial Cells? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
5.2.4 Analysis of the m107 and m108 Genes as Viral Factors Determining
the Epithelial Cell Tropism of MCMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
5.3 Identi