Influence of various coeffectors on differential carbon catabolite regulation exerted by CcpA [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Nicola Horstmann

Nhorstma

Sujets

• Biologie

Informations

• Publié par: friedrich-alexander-universitat_erlangen-nurnberg
• Publié le: 01 janvier 2006
• Nombre de lectures: 40
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 2 Mo

Extrait

Influence of various coeffectors on differential carbon
catabolite regulation exerted by CcpA







Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades









vorgelegt von

Nicola Horstmann

aus Erlangen







Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der
Universität Erlangen-Nürnberg


























Tag der mündlichen Prüfung: 28.09.2006

Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. D.-P. Häder
Erstberichterstatter: Prof. Dr. W. Hillen
Zweitberichterstatter: H. Sticht


Danke …


Zunächst möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Wolfgang Hillen für sein Interesse an dieser
Arbeit, seine Unterstützung und Ratschläge, die Möglichkeit, eigene Ideen einzubringen
und die hervorragenden Arbeitsbedingungen an seinem Lehrstuhl bedanken.

Herrn Prof. Dr. Heinrich Sticht danke ich für die freundliche Übernahme des
Zweitgutachtens.

Herrn Prof. Dr. Sticht und Wolfgang Müller danke ich zudem für ihre bioinformatischen
Arbeiten zur Vorhersage neuer Wechselwirkungspartner für HPr-Ser46-P, aus denen das
RbsR Projekt entstanden ist sowie für die hervorragende Zusammenarbeit.

Allen jetzigen und früheren Mitgliedern des Lehrstuhls für Mikrobiologie danke ich für die
nette Arbeitsatmosphäre, die gute Stimmung und etliche hilfreiche Tipps.
Mein Dank gilt insbesondere den Mitgliedern der Bacillus gruppe: Marco Diel, Gerald
Seidel, Susanne Glagla, Mareen Sprehe, Alex Wolf, Jessi Haag, Robert Düring und Na
Cong. Marco und Gerald danke ich für die gute Einarbeitung, Gerald zudem für seine
Einführung in die Biacoretechnik, ein erfolgreiches gemeinsames Projekt und viele
Diskussionen. Mareen danke ich für die Laborgemeinschaft und so manch unglaubliche
Geschichte, Susanne für ihre Freundschaft und dass ich mit den unzähligen Schulklassen
nicht allein war. Na Cong danke ich für ihre Beiträge während ihres F2/F3 Praktikums, für
leckeres chinesisches Essen und, dass ich jetzt bestens über China bescheid weiß.

Bei allen Verantwortlichen, v. a. den Computerspezialisten, bedanke ich mich für ihre
schnelle Hilfe sowie bei Eva und Gerald für ihre Hilfe bei Chromatographenreparaturen.

Den Running Microbes Lars, Didi und Klaus danke ich für sportliche Motivation und ihre
Begleitung beim “Spaziergang” durch die Fränkische Schweiz.

Danke auch an Herrn Dr. Rösch, den Sekretärinnen Frau Prell und Frau Wehr für die
hervorragende Organisation des Lehrstuhls und an Markus Müller, der immer zur Stelle
war, wenn wir mal wieder etwas kaputt gemacht haben. Bei Manuela Hanuschik und
Hildegard Stork bedanke ich mich für die enorme Arbeitserleicherung durch ihre
Spüldienste bzw. die Herstellung unzähliger Platten und Medien.

Meinen Eltern und Barbara & Philipp danke ich für ihre persönliche Unterstützung und der
kleinen Johanna für stärkende Knuddeleinheiten.Abbreviation index


Amp Ampicillin Dimensions
APSAmmonium persulphate 3k kilo (10 )
ATP Adenosine triphosphate -3m mili (10 )
A Absorbion at λ = x nm x -6µ micro (10 )
B. Bacillus -9n nano (10 )
bp base pairs -12p pico (10 )
BSA bovine serum albumin
CAA casamino acids

CCR carbon catabolite regulation
Units Cm Chloramphenicol
°C degree Celsius DMSO dimethylsulfoxide
DNA Desoxyribonucleic acid Da Dalton
DNase Desoxyribonuclease g gram
dNTP Desoxyribonucleotide h hour
DTT dithiothreitol l liter
E. Escherichia m mete
EDTA Ethylendiamin tetraacetate M Molar
Erm Erythromycin min minute
EtOH Ethanol s second
EtBr Ethidium bromide U unit
FBP fructose 1,6-bisphosphat V volt
Fig figure W watt
GFP green fluorescent protein
Glc-6-P glucose 6-phosphate
IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside
Kan Kanamycin
LB Luria Broth
NTA Nitrilotetraacidic acid
OD Optical density λ = x nm x
ONPG o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranoside
PAA polyacrylamide
PAGE Polyacrylamid gel electrophoresis
PCR polymerase chain reaction
rpm revolutions per minute
RT room temperature
SDS sodium dodecylsulfate
Tab. Table
Tc Tetracycline
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
% v/v % (volume/volume)
% w/v % (weight/volume)
wt wild type
x-Gal 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid





Abbreviation index


Amino acid nomenclature (IUPAC-IUB, 1969)
A Ala Alanine M Met Methionine
C Cys Cysteine N Asn Asparagine
D Asp Aspartate P Pro Proline
EGlu Glutamate Q Gln Glutamine
F Phe Phenylalanin R Arg Arginine
G Gly Glycine S Ser Serine
H His Histidine T Thr Threonine
I Ile Isoleucine V Val Valine
K LysLysine W Trp Tryptophan
L Leu Leucine Y Thy Thyrosine




Nucleotides
A Adenosine
C Cytosine
G Guanosin
T Thymidine
N A, C, G or T





Index I

Index

1 1 Zusammenfassung/Summary

3 2 Introduction

2.1 Regulation of gene expression in response to changing 3
conditions

2.2 The PTS: compounds and functions 4

2.3 CCR in B. subtilis and other gram-positive bacteria with low 5
GC content

2.4 The structure of the CcpA-HPr-Ser46-P-cre complex 6

2.5 The allosteric switch mechanism 8

2.6 HPr-Ser-P and Crh-Ser46-P act differently in CcpA 9
dependent CCR

2.7 CcpA dependent CCR: a global mechanism of gene regulation 10

2.8 Differential regulation of various promoters and possible 11
regulatory mechanisms

2.9 Scope of the thesis 13

14 3 Materials and methods

3.1 Materials 14

3.1.1 Chemicals 14
3.1.2 Instruments 15
3.1.3 Commercially available systems („kits“) 16
3.1.4 Auxiliary materials 16
3.1.5 Proteins and enzymes 16
3.1.6 Oligonucleotides 17
3.1.7 Plasmids 19
3.1.8 Bacterial strains 20

3.2 Media and buffers 21

3.2.1 Media 21
3.2.2 Buffers 22

3.3 Methods 24

3.3.1 General methods 24
3.3.2 Cloning 24 Index II

3.3.2.1 General polymerase chain reaction (PCR) 24
3.3.2.2 Colony PCR 24
3.3.2.3 DNA assembling 24
3.3.2.4 T7 Endonuclease I treatment 25
3.3.2.5 Restriction 25
3.3.2.6 Vector dephosphorylation 25
3.3.2.7 Ligation 25
3.3.2.8 Transformation of E. coli 25
3.3.3 In vivo characterization in B. subtilis 25
3.3.3.1 Preparation of naturally competent B. subtilis strains 25
3.3.3.2 Transformation of B. subtilis 25
3.3.3.3 Western blotting 26
3.3.3.4 Detection of α-amylase activity 26
3.3.3.5 Determination of ß-galactosidase activities 26
3.3.4 Growth of bacteria and protein overexpression 27
3.3.4.1 Growth of bacteria and protein overexpression 27
3.3.4.2 Cell disruption 27
3.3.4.3 Overexpression- and heat stability tests 27
3.3.5 Protein biochemistry 27
3.3.5.1 Preparation of kinase extract 27
3.3.5.2 Purification of HPr and Crh 27
3.3.5.3 Purification of CcpA(His) 28 6
3.3.5.4n of RbsR(His) 28 6
3.3.5.5 Storage and dialysis of proteins 28
3.3.5.6 Hybridization of DNA: 28
3.3.5.7 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 28
3.3.5.8 Surface plasmon resonance spectroscopy (SPR) 29

30 4 Results

4.1 Improving cloning of ccpA mutants in E. coli 30

4.1.1 Cloning of pWH143 and pWH144 30
4.1.2 Characterization of pWH143 and pWH144 in E. coli 31
4.1.3 WB. subtilis 32

4.2 Bridging of N-terminal core domains in CcpA accounts for 34
differential regulation

4.2.1 Site-directed mutagenesis of ccpA 34
4.2.2 Quantification of CCR of different promoters 34

4.3 Establishing a novel screening system for differential 38
regulating CcpA mutants
Index III

4.4 The HPrH15-CcpAD297 contact specifies the stimulatory 41
effect of glycolytic intermediates

4.4.1 Selection and mutagenesis of suitable residues 41
4.4.2 Overproduction and purification of HPr/Crh mutants 42
4.4.3 Analysis of CcpA binding 43
4.4.4 Mutation of CcpA residue 297 does not affect the affinity to 44
HPr-Ser46-P or Crh-Ser46-P
4.4.5 Analysis of FBP and Glc-6-P stimulation of CcpA-coeffector 45
interaction
4.4.6 Analysis of xylA cre binding 48
4.4.7 In vivo contribution of glycolytic intermedia