Inhibitors of bacterial and mammalian hyaluronidases [Elektronische Ressource] : design, synthesis and structure activity relationships with focus on human enzymes [[Elektronische Ressource]] / vorgelegt von Martin Spickenreither

Martin Spickenreither

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• Publié par: universitat_regensburg
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 13
• Langue: Deutsch
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Extrait

Inhibitors of Bacterial and Mammalian
Hyaluronidases: Design, Synthesis and
Structure-Activity Relationships with Focus on
Human Enzymes




Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der
Naturwissenschaftlichen Fakultät IV – Chemie und Pharmazie –
der Universität Regensburg






vorgelegt von
Martin Spickenreither
aus Tännesberg
2007
Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von April 2004 bis November 2007 unter
der Leitung von Herrn Prof. Dr. A. Buschauer am Institut für Pharmazie der
Naturwissenschaftlichen Fakultät IV - Chemie und Pharmazie - der Universität
Regensburg.





























Das Promotionsgesuch wurde eingereicht im November 2007.


Tag der mündlichen Prüfung: 14. Dezember 2007


Prüfungsausschuß: Prof. Dr. J. Heilmann (Vorsitzender)
Prof. Dr. A. Buschauer (Erstgutachter)
Prof. Dr. G. Bernhardt (Zweitgutachter)
Prof. Dr. H.-A. Wagenknecht (Prüfer)




























„Für Frodo“
Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bedanken bei:

Herrn Prof. Dr. A. Buschauer für die Möglichkeit an diesem interessanten Projekt
arbeiten zu dürfen, für die forscherische Freiheit, seinen wissenschaftlichen
Anregungen und für seine konstruktive Kritik bei der Durchsicht dieser Arbeit.

Herrn Prof. Dr. G. Bernhardt für seine wissenschaftliche Anleitung, seine
Unterstützung beim Lösen experimenteller Probleme, sein Interesse am Fortgang
der Experimente, für die Durchsicht von Kapitel 10 und für die Erstellung des
Zweitgutachtens.

Herrn Prof. Dr. S. Dove für seine Unterstützung während dieser Arbeit insbesondere
im Bereich des Molecular Modeling und für die Durchsicht des Vitamin C Kapitels.

Frau Dr. E. Hofinger, die diese Arbeit durch die rekombinante Expression der
humanen Hyaluronidasen erst möglich machte, für ihre große Hilfe und Anleitung bei
Fragen aller Art.

Frau L. Schneider für die Hilfe beim Testen der Substanzen.

Frau S. Bollwein für die Hilfe bei Praktikumsbetreuung und Durchführung der
Kristallviolett Assays.

Herrn Prof. Dr. R. Schobert (Universität Bayreuth), Herrn Prof. Dr. E. von Angerer
und Herrn Prof. Dr. J. Heilmann für die zur Verfügung gestellten Substanzen.

Frau S. Heinrich, Frau M. Wechler und Herrn P. Richthammer für die Hilfsbereitschaft
und Unterstützung bei vielen organisatorischen und technischen Dingen.

Allen Mitarbeitern der analytischen Abteilungen der Fakultät für die Aufnahme von
NMR- und Massenspektren, sowie der Durchführung der Elementaranalysen.

Frau Anna Hezinger für die Hilfe zur CMC-Bestimmung.

Dem „Hyase-Team“ Herrn Dr. A. Botzki, Frau Dr. J. Hoechstetter, Herrn Dr. S. Braun,
Frau Dr. E. Hofinger und Herrn Dr. P. Jarzyna für die Einführung in das
Hyaluronidase-Thema, der Inspiration durch die vielen fachlichen Diskussionen und
der guten Zusammenarbeit in der Gruppe.

Meinen Laborkollegen Herrn Dr. A. Brennauer, Herrn Dr. S. Braun, Frau M. Ertel und
Herrn F. Binder für das hervorragende Arbeitsklima, den vielen fruchtbaren
Diskussionen und der Unterstützung bei allen Dingen im und neben dem Laboralltag.

Meinen studentischen Hilfskräften und Schwerpunktpraktikanten für ihre engagierte
Mitarbeit im Labor.

Allen Mitgliedern des Lehrstuhls für ihre Kollegialität, Hilfsbereitschaft, das gute
Arbeitsklima und den vielen geselligen Stunden auch außerhalb der Universität.

Meinen Eltern und Geschwistern auf deren Unterstützung ich mich jederzeit
verlassen konnte.

Meinen Freunden, insbesondere Kathy, Verena und Miri für den Zusammenhalt und
Spaßfaktor der letzten Jahre.

Meiner Freundin Anja.


Contents


Contents



1 Introduction...............................................................................................1
1.1 Hyaluronic acid............................................................................................. 1
1.1.1 Structure and physicochemical properties ............................................ 1
1.1.2 Hyaluronan in the organism .................................................................. 3
1.2 Hyaluronidases............................................................................................. 5
1.2.1 Classification of hyaluronidases............................................................ 6
1.2.2 Hyaluronidases from eukaryotes........................................................... 7
1.2.3 Hyaluronidases from prokaryotes........................................................ 12
1.3 Medical applications of hyaluronan and hyaluronidases ............................ 14
1.4 References................................................................................................. 16

2 Scope and objectives .............................................................................26

3 Methods for the determination of hyaluronidase activity................... 29
3.1 Introduction ................................................................................................ 29
3.2 Morgan-Elson assay................................................................................... 30
3.3 Turbidimetric assay .................................................................................... 31
3.4 Influence of the pH value on enzymatic activity.......................................... 32
3.5 Experimental procedures ........................................................................... 33
3.5.1 Materials and methods........................................................................ 33
3.5.2 Morgan-Elson assay 34
3.5.3 Turbidimetric assay ............................................................................. 35
3.6 References................................................................................................. 37

4 Purification of human hyaluronidases Hyal-1 and PH-10 ...................39
4.1 Recombinant human Hyal-1....................................................................... 39
4.2 Recombinant human PH-20 40
4.3 References 40

I Contents
5 Inhibitors of hyaluronidases: reference compounds investigated
under standardized conditions..............................................................41
5.1 Hyaluronidase inhibitors reported in the literature ...................................... 41
5.2 Inhibitory activities of selected reference compounds as determined in the
turbidimetric assay ..................................................................................... 42
5.3 References................................................................................................. 46

6 Derivatives of the glucurono-6,3-lactone as hyaluronidase
inhibitors..................................................................................................50
6.1 Introduction ................................................................................................ 50
6.2 Chemistry ................................................................................................... 51
6.3 Inhibition of hyaluronidases: results and discussion................................... 55
6.3.1 Inhibition of hyaluronidases by 1-O-alkyl-glucurono-6,3-lactones ....... 55
6.3.2 1-O-Alkyl-glucuronic acids and 1-O-alkyl-glucuronic acid amides....... 61
6.4 Summary.................................................................................................... 66
6.5 Experimental Section ................................................................................. 67
6.5.1 General conditions .............................................................................. 67
6.5.2 Chemistry............................................................................................ 68
6.6 References................................................................................................. 93

7 Ascorbic acid derivatives as potent inhibitors of bacterial and
mammalian hyaluronidases...................................................................95
7.1 Introduction ................................................................................................ 95
7.2 Chemistry ................................................................................................... 97
7.3 Inhibition of hyaluronidases: results and discussion................................. 109
7.3.1 6-O-Acylated ascorbic acid derivatives ............................................. 110
7.3.2 “Bivalent” ascorbic acid derivatives..............................................