On the crosstalk between transmembrane and nucleotide binding domains of the ABC transport complex TAP [Elektronische Ressource] / von Giani Oancea

Giani Oancea

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• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 30
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Extrait

On the crosstalk between transmembrane
and nucleotide binding domains
of the ABC transport complex TAP



Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften


vorgelegt beim Fachbereich
Biochemie, Chemie und Pharmazie
der Johann Wolfgang Goethe-Universität
in Frankfurt am Main







von
Giani Oancea
aus
Onesti, Rumänien


Frankfurt am Main, 2008


(D30)


















vom Fachbereich Biochemie, Chemie und Pharmazie der
Johann Wolfgang Goethe-Universität als Dissertation angenommen.



Dekan: Prof. Dr. Dieter Steinhilber


1. Gutachter: Prof. Dr. Robert Tampé
2. Gutachter: Prof. Dr. Bernd Ludwig


Datum der Disputation: 2009-03-25





















Teile der vorliegenden Arbeit wurden veröffentlicht in:

Herget M*, Oancea G*, Schrodt S, Karas M, Tampé R, Abele R
Mechanism of substrate sensing and signal transmission within an ABC
transporter: use of a Trojan horse strategy.
J Biol Chem. 2007 Feb 9;282(6):3871-80.
* Both authors contributed equally to this work.

Oancea G, O’Mara M L, Bennett W F D, Tieleman D P, Abele R, Tampé R
Structural arrangement of the transmission interface in the ABC transporter TAP critical for
antigen binding and translocation.
PNAS 2009 Mar 18 [Epub ahead of print]. Deutsche Zusammenfassung
Deutsche Zusammenfassung

TAP („transporter associated with antigen processing“) spielt eine zentrale Rolle in der
MHC („major histocompatibility complex“) I abhängigen Antigenprozessierung. Dabei
transportiert TAP proteasomale Degradationsprodukte vom Zytosol ins Lumen des
Endoplasmatischen Retikulums (ER). Dort werden die antigenen Peptide auf MHC I
Moleküle geladen. Anschließend werden peptidbeladene-MHC Moleküle an die
Zelloberfläche transportiert, um ihre antigene Fracht zytotoxischen T-Lymphozyten zu
präsentieren. Erkennen diese zytotoxischen T-Zellen via dem T-Zellrezeptor virale oder
onkogene Proteinfragmente, führt dies zur Elimination der virusinfizierten oder
transformierten Zelle.
TAP gehört der Familie der ABC („ATP binding cassette“) Transporter an, die die
Energie der ATP Hydrolyse ausnutzen, um Substrate über Membrane zu transportieren. TAP
bildet einen Heterodimer bestehend aus TAP1 und TAP2. Jede Untereinheit baut sich aus
einer N-terminalen Transmembrandomäne (TMD) und einer C-terminalen
Nukleotidbindungsdomäne (NBD) auf. Die TMDs bilden die Translokationspore und die
Peptidbindungstasche. Die NBDs binden und hydrolysieren ATP, was den Peptidtransport
über die Membran antreibt. Die Transmembrandomänen bestehen jeweils aus 10
Transmembranhelizes, wobei die sechs C-terminalen Transmembranhelizes in Kombination
mit der Nukleotidbindungsdomäne jeder Untereinheit den Kernkomplex formen, welcher für
den Peptidtransport ausreichend ist. Wie aus einem Homologiemodell von TAP basierend auf
der Röntgenkristallstruktur des bakteriellen ABC-Exporters Sav1866 hervorgeht, sind die
Transmembranhelizes auf der extrazellulären Seite durch kurze Schleifen–helikale α
verbunden. Die zytosolischen Schleifen (CL) dagegen stellen Verlängerungen der
Transmembranhelizes dar, die durch eine ca. 10 Aminosäure umfassende, parallel zur
Membranebene liegende Kopplungshelix (CH) verbunden sind. Interessanterweise bilden
diese CLs sowohl Kontakte mit der NBD der eigenen (cis-Interaktion) als auch mit der
gegenüberliegenden Untereinheit (trans-Interaktion). In den NBDs sind vor allem der Q-
Schleife wie auch der für ABC-Exporter einzigartige X-Schleife in diese
Interdomäneninteraktion involviert. In biochemischen Studien konnte gezeigt werden, dass
IDeutsche Zusammenfassung
die TMDs und NDBs während des Transportvorgangs in einer gekoppelten Art und Weise
zusammenarbeiten.
Die zentrale Frage im ABC-Transporterfeld beschäftigt sich momentan damit, die
Bedeutung dieser Interaktionsschnittstelle aufzuklären und strukturelle Änderungen dieser
Schnittstelle im Verlauf des Transportvorgangs aufzuklären.
Die Ziele meiner Doktorarbeit waren (i) den Mechanismus zu entschlüsseln, wie die
Anwesenheit von gebundenem Peptid in der Peptidbindungstasche an die NBDs übermittelt
wird. (ii) Desweiteren sollte die Bedeutung dieser Transmissionsschnittstelle aufgeklärt
werden und (iii) weiterhin strukturelle Veränderungen während des Transportzyklus
untersucht werden.
Mit Hilfe eine kleinen, chemischen Protease kovalent an Peptidliganden von TAP
gebunden, konnte eine bisher nicht beschriebene Interaktionsstelle detektiert werde. Um die
physikalische Interaktion dieses in der CL1 von TAP1 gelegen Bereichs mit dem Peptid
nachzuweisen, wurden durch gezielte Mutagenes einzelne Cysteine in cysteinloses TAP
eingeführt und zusammen mit wt TAP2 mit dem Baculovirusexpressionssystem in
Insektenzellen exprimiert. Die eingeführten Cysteine hatten keinen Einfluss auf die Faltung
von TAP, da alle TAP-Varianten in vergleichbaren Mengen exprimiert wurden und die
Peptidbindung durch diese Mutationen nicht beeinflusst wurde. Allerdings interferierten
Cysteinsubstitutionen der am stärksten konservierten Aminosäurenreste in diesem Bereich
(G282C, I284C und R287C) sehr stark mit dem Peptidtransport. Die Entkopplung zwischen
Peptidbindung und Transport in diesen Mutanten legt nahe, dass diese Region in CL1 von
TAP1 eine Art Transmitterfunktion einnimmt, indem sie den Beladungszustand der
Peptidbindungstasche in der TMD an die NBD übermittelt. Die physikalische Nähe des
Peptids zu diesem Transmitter konnte mittels oxidativer Quervernetzung von Cysteinen in
dieser Region mit einem Cystein des gebunden Peptids nachgewiesen werden. Neben der
Position 288 stehen allerdings schwächer die Positionen 284, 285 und 286 in TAP1 in
Kontakt mit dem gebundenen Peptid. Durch Zugabe von ATP wird die Wechselwirkung mit
der Position 285 unterbrochen, was auf eine strukturelle Flexibilität von TAP in diesem
IIDeutsche Zusammenfassung
Bereich hindeutet. Position 288 dagegen steht sowohl in Anwesenheit sowie in Abwesenheit
von Nukleotiden (ATP, ADP, AMP-PNP, ATP γS) in Kontakt mit dem gebundenen Peptid.
Allerdings ging diese Interaktion in Anwesenheit von ADP-AlFx, welches den
Übergangszustand der Hydrolyse fixiert, verloren. Zusammenfassend zeigen diese
Ergebnisse, dass der neu identifizierte Bereich als Peptidsensor wirkt, der sich im Verlauf des
Transportzyklus strukturell reorganisiert und somit als Transmitter zwischen TMD und NBD
fungiert.
Um den molekularen Aufbau des CL1 zu entschlüsseln, wurde ein minimal invasiver
Ansatz gewählt, bei dem die Zugänglichkeit von einzel eingeführten Cysteinen in diesem
Bereich mittels thiolspezifischer Fluoreszenzfarbstoffen mit unterschiedlicher
Hydrophobizität analysiert wurde. Die N-terminalen Postionen von CL1 (Q277C, G282C,
N283C und I284C) zeigten eine hohe Markierungseffizienz für den hydrophilen Farbstoff
Iodacetamidofluorescein, den amphiphilen Farbstoff BODIPYmaleimid sowie den
hydrophoben Fluoreszenzfarbstoff Coumarinmaleimid, sodass diese Region exponiert zu
schein sein. Der C-terminale Bereich von CL1 dagegen (M285C, S286C, R287C und V288C)
zeigte nur mit Coumarinmaleimid eine hohe Markierungseffizienz, was darauf hinweist, dass
diese Seitenketten in einer hydrophoben Umgebung sich befinden.
Um auch kleinste strukturelle Änderungen der CL1 während des Transportvorgangs zu
identifizieren, wurden Markierungskinetiken mittels BODIPYmaleimid im nukleotidfreien,
im ATP gebundenen sowie im posthydrolytischen Zustand bestimmt. So ist zum Beispiel die
Markierungsratenkonstante der Mutante I284C im nukleotidfreien Zustand 100-mal schneller
als im ATP-gebundenen Zustand und 36-mal schneller als in Gegenwart von ADP. Betrachtet
man die Ratenkonstante der Markierung, so konnten die CL1-Mutanten in vier Gruppen
unterteilt werden:
i. Seitenketten mit einer langsamen Markierungskinetik für alle getesteten Bedingungen
(N283C, R287C, V288C)
IIIDeutsche Zusammenfassung
ii. Seitenketten mit eine schnelleren Markierungskinetik im nukleotidfreien Zustand als
im ATP-gebundenen Zustand (I284C, M285C, S286C)
iii. Seitenketten mit eine schnelleren Markierungskinetik in Gegenwart von ATP als im
nukleotidfreien Zustand (G282C)
iv. Seitenketten mit eine schnelleren Markierungskinetik im nukleotidfreien Zustand oder
in Gegenwart von ADP als im ATP-gebundenen Zustand (Q277C)
Neben der Ratenkonstante wurden die einzelnen Mutanten auch nach der
Markierungseffizienz klassifiziert, wobei diese nicht direkt mit den Ratenkonstanten
korreliert:
i. Seitenketten mit der höchsten Markierungseffizienz im ATP gebundenen Zustand
(Q277C)
ii. Seitenketten mit der höchsten