Structural and biophysical studies of adhesive binding by classical cadherins [Elektronische Ressource] / Julia Brasch

Julia Brasch

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• Publié par: gottfried_wilhelm_leibniz_universitat_hannover
• Publié le: 01 janvier 2011
• Nombre de lectures: 26
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 6 Mo

Extrait

Structural and Biophysical Studies
of
Adhesive Binding by Classical Cadherins













Von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover
zur Erlangung des Grades

Doktorin der Naturwissenschaften
Dr. rer. nat.

genehmigte Dissertation

von
Dipl.-Biochem. Julia Brasch
geboren am 16. Januar 1982 in Braunschweig

2011



Referent: Prof. Dr. rer. nat. Bernd Otto

Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. Walter Müller

Drittprüfer: Prof. Dr. Lawrence S. Shapiro

Weitere Prüfer: Prof. Dr. rer. nat. Hans-Jörg Jacobsen

Tag der Promotion: 21. April 2011



The present study was carried out at the Institute of Molecular Biophysics and Biochemistry,
Columbia University in the City of New York, in the Laboratory of Prof. Dr. Lawrence
Shapiro in collaboration with Prof. Dr. Bernd Otto, at the Institute of Biochemistry,
Tiermedizinische Hochschule Hannover.


Parts of this thesis have been published in:

Brasch J, Harrison OJ, Ahlsen G, Carnally SM, Henderson RM, Honig B, Shapiro L. (2010)
Structure and binding mechanism of vascular endothelial cadherin, a divergent classical
cadherin. Journal of Molecular Biology, 408 (1): 57-73.

Harrison OJ, Jin, X, Hong S, Bahna F, Ahlsen G, Brasch J, Wu Y, Vendome J, Felsovalyi K,
Hampton CM, Troyanovsky RB, Ben-Shaul A, Frank J, Trojanovksy SM, Shapiro L, Honig
B. (2010) The extracellular architecture of adherens junctions revealed by crystal
structures of type I cadherins. Structure, 19 (2): 244-56.

Harrison OJ, Bahna F, Katsamba PS, Jin X, Brasch J, Vendome, J, Ahlsen, G, Carrol KJ,
Price SR, Honig B, Shapiro L. (2010) Two-step adhesive binding by classical cadherins.
Nature Structural Molecular Biology, 17 (3): 348-57.

Ciatto C, Bahna F, Zampieri N, CanSteenhouse HC, Katsamba PS, Ahlsen G, Harrison OJ,
Brasch J, Jin X, Posy S, Vendome J, Ranscht B, Jessel TM, Honig B, Shapiro L. (2010) T-
cadherin structures reveal a novel adhesive binding mechanism. Nature Structural
Molecular Biology, 17 (3): 339-47.




Zusammenfassung
Cadherine stellen eine große Familie von transmembranen Adhäsionsrezeptoren auf Zelloberflächen
dar, deren erlesene Bindungsspezifitäten für die Formation und Instandhaltung der Gewebearchitektur
von Vertebraten und Invertebraten verantwortlich sind. Circa 100 nicht klassische und 19 klassische
Cadherine sind in Wirbeltiergenomen kodiert. Klassische Cadherine gliedern sich in zwei
Unterfamilien: Typ I und II, von denen beide Kalzium abhängige Zelladhäsion vermitteln, die
morphologischen Prozessen in Wirbeltieren zu Grunde liegen. Typ I Cadherine sind zumeist
großflächig in Keimblättern und Epithelien exprimiert, wohingegen Typ II Cadherine im sich
entwickelnden und erwachsenen zentralen Nervensystem (ZNS) weitaus feingliedriger und auch
überlappend exprimiert sind. Vaskulär-endotheliales (VE) Cadherin, ein divergentes Mitglied der Typ
II Familie, vermittelt homophile Zelladhäsion ausschließlich im Endothel, das die Blutgefäße
auskleidet und ist unabkömmlich für vaskuläre Angiogenese und Instandhaltung der Vaskulatur. Für
bakteriell produzierte VE-cadherin Ektodomän Fragmente wurde ein Adhäsionsmodel vorgeschlagen,
bei dem sich das Protein auf derselben Zelloberfläche lateral zu Trimeren organisiert, die mit Trimeren
nebeneinander liegender Zellen trans adhäsive Hexamere bilden. Dieses Model weicht stark vom
allgemein akzeptierten Bindungsmechanismus anderer Cadherine ab, der als ‚strand swap’
Mechanismus bezeichnet wird, da er auf dem Austausch N-terminaler Regionen der extrazellulären
cadherin (EC) ähnlichen Domänen zwischen zwei Protomeren besteht, aber keine Bildung von
Trimeren involviert. Die vorliegende Dissertation befasst sich mit der detaillierten Charakterisierung
des adhäsiven Bindungsmechanismus von VE-cadherin Ektodomänen, die in Säugetierzellen
produziert wurden. Biophysikalische Studien, wie analytische Ultrazentrifugation, Größenausschluß-
chromatographie, Lichtstreudetektion und Aggregation von Liposomen sowie spektroskopische
Rasterkraftmikroskopie von Proteinen in Lösung und Elektronen-mikroskopie künstlicher
Zellverbindungen, zeigen, dass VE-cadherin den ‚strand swap’ Mechanismus klassischer Cadherine
adoptiert, indem ausschließlich trans adhäsive Dimere gebildet werden. Zusätzlich wurde gefunden,
dass die beschriebenen Trimere Artefakte repräsentieren, deren Bildung durch die Abwesenheit von
Glykosylierung bei bakteriell produzierten Proteinen hervorgerufen wurde. Die Kristallstruktur der
adhäsiven Domänen EC1-2 von VE-cadherin mit einer Auflösung von 2.1Å enthüllte Homodimere,
deren Formation der ‚strand swap’ Mechanismus zu Grunde liegt. Die adhäsive Interaktionsseite ist
einzigartig, da sie Charakteristika von Typ I und II Cadherinen vereint, was zu einer unüblichen
Konfiguration des Dimers führt. VE-cadherin stellt daher einen strukturellen Außenseiter der Typ II
Cadherine dar. Eine Studie, die homo- und heterophile Interaktionen von Typ II Cadherinen
untersuchte, schlägt zum ersten Mal einen Bindungscode für diese Zelladhäsionsproteine vor, der die
Spezifität ihres heterophilen Bindungsmusters entschlüsselt. Interessanter Weise wurde auch eine
Interaktion zwischen Typ I N- und Typ II VE-cadherin, identifiziert, die unabhängig vom ‚strand
swap’ Mechanismus ist, und eine neuartige Form einer cis-Interaction verspricht.
Schlüsselwörter: Zell-Zell-Adhäsion / Cadherine / Kristallstruktur.
Abstract
Cadherins constitute a large family of cell surface transmembrane adhesion receptors whose binding
specificity is important in generation and maintenance of tissue architecture in vertebrates and
invertebrates. About 100 nonclassical cadherins and approximately 18 classical cadherins are encoded
in vertebrate genomes. Classical cadherins, comprised of two subfamilies the type I and type II
cadherins, mediate calcium dependent cell-cell adhesion that is essential for morphogenesis in
vertebrates. Type I cadherins are typically expressed broadly in germ layers or epithelia, whereas type
II cadherins have a finely grained expression pattern, which is overlapping and primarily restricted to
the developing and adult nervous system. A divergent member of the type II cadherin family, vascular
endothelial (VE) cadherin, mediates homophilic adhesion in the vascular endothelium and is crucial
for vascular angiogenesis, maintenance and restoration of vascular integrity after injury. In the past a
binding model for VE-cadherin has been proposed based on data from bacterially produced
ectodomain fragments in which the protein forms trimers laterally on the same cell surface, which bind
to trimers presented by juxtaposed cells to form adherent hexamers. This model is substantially
different from the well characterized binding mechanism of other classical cadherins, which is
mediated by N-terminal extracellular cadherin (EC) domains in a three dimensional domain swapping
mechanism, termed the ‘strand swap mechanism’, and involves no trimer interactions. Here I report
extensive studies of purified mammalian produced VE-cadherin ectodomains to elucidate the adhesive
binding mechanism of this crucial protein. Biophysical studies such as analytical ultracentrifugation,
size exclusion chromatography and multi angle light scattering in addition to liposome aggregation
and atomic force microscopy imaging studies and cryo electron microscopy of artificial junctions
reveal that VE-cadherin forms adhesive trans dimers between monomers emanating from opposing
cell surfaces and not hexamers. Trimerization of bacterially produced protein is found to be artifactual
due to lack of glycosylation. I present the 2.1Å resolution crystal structure of VE-cadherin adhesive
domains EC1-2 which reveals that the strand swap mechanism common to classical cadherins
underlies homodimerization. The adhesive interface of VE-cadherin is unique as it features
characteristics of both cadherin subfamilies. Two tryptophan residues are exchanged which is
reminiscent of type II cadherins, but an extended non polar interface region specific to type II
subfamily members is absent as observed for type I cadherins, resulting in an unusual overall dimer
organization. VE-cadherin can therefore be described as a structural outlier among classical cadherins.
A systematic binding study of homophilic and heterophilic interactions of type II cadherins, including
VE-cadherin, was performed and reveals evidence for a new binding code which appears to govern the
specificity of these important CNS cell adhesion proteins. In addition, for the first time, a strong
heterophilic interaction between type I N-cadherin and type II VE-cadherin could be identified, which
appears to be strand swap independent and may represent a novel cis interaction between these
cadherins.