Synthesis and characterization of subtype-selective estrogen receptor ligands and their application as pharmacological tools [Elektronische Ressource] : cross-talk between estrogen and NPY Y_1tn1 receptors in human breast cancer cells / vorgelegt von Martin Memminger

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• Publié le: 01 janvier 2009
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Extrait

Synthesis and Characterization of Subtype-Selective
Estrogen Receptor Ligands and their Application as
Pharmacological Tools

Cross-Talk between Estrogen and NPY Y Receptors 1
in Human Breast Cancer Cells




Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
der Naturwissenschaftlichen Fakultät IV – Chemie und Pharmazie –
der Universität Regensburg







vorgelegt von
Martin Memminger
aus Heretsried (Landkreis Augsburg)

2009 Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Juli 2005 bis März 2009 unter der
Leitung von Herrn Prof. Dr. A. Buschauer, Herrn Prof. Dr. G. Bernhardt und Herrn Prof.
Dr. E. von Angerer am Institut für Pharmazie der Naturwissenschaftlichen Fakultät IV –
Chemie und Pharmazie – der Universität Regensburg.






















Das Promotionsgesuch wurde eingereicht im März 2009

Tag der mündlichen Prüfung: 24. März 2009

Prüfungsausschuss:
Prof. Dr. F.-M. Matysik (Vorsitzender)
Prof. Dr. G. Bernhardt (Erstprüfer)
Prof. Dr. E. von Angerer (Zweitprüfer)
Prof. Dr. A. Göpferich (Drittprüfer) I















für meine Familie II
Danksagungen

An dieser Stelle möchte ich mich bedanken bei:

Herrn Prof. Dr. A. Buschauer für die Möglichkeit zur Promotion auf einem so
interessanten Arbeitsgebiet, sowie sein Engagement und seine Unterstützung,

Herrn Prof. Dr. G. Bernhardt für die engagierte Betreuung, die praktischen Ratschläge
und hilfreichen Diskussionen und seine konstruktive Kritik bei der Durchsicht der Arbeit,

Herrn Prof. Dr. E. von Angerer für die persönliche Betreuung, seine fachliche Anleitung
und seine Ideen auf dem Gebiet der Synthese, sowie die kritische Durchsicht der Arbeit,

3meinem Kollegen Max Keller für die Bereitstellung des Radioliganden [ H]-UR-MK-114
und der in Kapitel D dargestellten Autoradiographie-Aufnahme, seine Unterstützung und
Anleitung bei den Y R Bindungs-Assays und die angenehme Zusammenarbeit, 1

meiner Kollegin Nathalie Pop für die hilfreiche Zusammenarbeit bei der Durchführung
der cAMP Assays,

Frau E. Schreiber für die Durchführung der Calcium-Assays und ihre praktische Hilfe
bei den cAMP Assays,

Frau S. Bollwein für die Durchführung der Estrogenrezeptor-Gehaltsbestimmungen und
einiger Cytotoxizitätsversuche, sowie die Einführung in die Arbeitstechniken der
Zellkultur,

Herrn P. Richthammer für seine Hilfe bei allen möglichen technischen Problemen im
Laboralltag und die aufheiternden Gespräche,

3meinem Kollegen Patrick Igel für die Bereitstellung des Radioliganden [ H] UR-PI-294
sowie die hilfreichen Anregungen und Diskussionen,
III
Herrn D. Schnell für die Durchführung des in Kapitel F dargestellten RT-PCR
Experiments zur Analyse der H R Expression in Brustkrebszellen, 4

A. Pöschl, K. Dirr, P. Memminger, I. Brunskole, S. Penz, M. Schmid, J. Söldner, S.
Söldner und V. Thalhammer für ihre engagierte und zuverlässige Mitarbeit an einigen
Projekten dieser Arbeit im Rahmen verschiedener Forschungspraktika,

den Mitarbeitern der analytischen Abteilung der Fakultät für die Aufnahme der Massen-
und NMR-Spektren und die Durchführung der Elementaranalysen,

Frau M. Wechler und Frau S. Heinrich für ihre wertvolle Unterstützung bei organisa-
torischen Problemen,

allen Mitgliedern des Lehrstuhls für ihre Kollegialität und für das gute Arbeitsklima,

der Deutschen Forschungsgemeinschaft für die finanzielle Unterstützung und
wissenschaftliche Förderung im Rahmen des Graduiertenkollegs 760,

meinen Eltern und Geschwistern für ihre Unterstützung,

meiner Frau Beate und unseren Kindern Diana, Felicia und David für ihre Geduld und
ihr Verständnis.



IV
Poster Presentations

th4 Summer School Medicinal Chemistry, Regensburg, October 2008:
Memminger, M., Keller, M., Bernhardt, G., Buschauer A., von Angerer, E.
“Estrogen induced neuropeptide Y Y receptor expression in human MCF-7 breast 1
cancer cells”

Annual Meeting of the GDCh, Fachgruppe Medizinische Chemie, “Frontiers in
Medicinal Chemistry”, Regensburg, March 2008:
Memminger, M., Keller, M., Bernhardt, G., Buschauer A., von Angerer, E.
“Studies on the Cross-talk Between the NPY Y Receptor and the Estrogen Receptor in 1
MCF-7 Breast Cancer Cells”

Annual Meeting of the German Pharmaceutical Society (DPhG), Erlangen, October
2007:
Memminger, M., Keller, M., Bernhardt, G., Buschauer A., von Angerer, E.
“Estrogen Receptor Mediated NPY Y Receptor Up-Regulation in MCF-7 Breast Cancer 1
Cells”

rd3 Summer School Medicinal Chemistry, Regensburg, September 2006:
Memminger, M., Bernhardt, G., Buschauer, A., von Angerer, E.
“New subtype-selective estrogen receptor antagonists as pharmacological tools for the
investigation of estrogen receptor signalling pathways”



V
Contents

A General Introduction 1

1 1Structure and Function of Estrogen Receptors (ERs) α and β
2 Ligands of the Estrogen Receptor 3
2.1 Clinically Relevant ER Ligands: Antiestrogens and SERMs 3
2.2 ER Subtype-Selective Ligands: Recent Advances 5

3 Molecular Mechanisms for Estrogen Action 8
3.1 The Classical Pathway to Transcription Activation: Ligand Binding 8
3.2 Cross-Talk Signalling Pathways: Estrogen Receptor
Phosphorylation 11

4 Non Genomic Estrogen Action via Membrane Bound ER 13
5 References 15

B Scope and Objectives 21

C Synthesis and biological Characterization of New Estrogen
Receptor Ligands 25


1 Pharmacological Test System 25
1.1 Radiometric Binding Assay 25
1.2 Luciferase Assay 26
1.2.1 Principles of the Gene Reporter Assay 26
1.2.2 Optimization of the Luciferase Assay 27
1.3 Proliferation Assay Using Human Mammary Carcinoma Cell Lines 29
2 2-Arylbenzo[b]furans 31
2.1 Design of Potential New ERβ-Selective 2-Arylbenzo[b]furan-based
32Antiestrogens

2.2 Chemistry 33
2.2.1 Synthesis of Side Chains 33VI
2.2.2 Synthesis of the 2-Aryl-7-formylbenzofuran Building Block 34
2.2.3 Introduction of Aliphatic Side Chains 36
2.3 Biological Characterization of the 2-Phenylbenzofurans 39
2.3.1 Binding Affinities to Human Estrogen Receptors (ERα and
39ERβ)
2.3.2 Determination of Estrogenic and Antiestrogenic Activity in the
Luciferase Assay 41

3 Estrogen Receptor Ligands Based on a Tetrahydroisoquinoline
Scaffold
44

3.1 44Design of Potential ERα Selective “Pure Antagonists”
3.2 Chemistry 45
3.2.1 Synthesis of Side Chains 45
3.2.2 of N-Aryltetrahydroisoquinolines 46
3.2.3 N-Trifluoroacetly and N-Phenylsulfonyl Substituted
Tetrahydroisoquinolines 50
3.2.4 Unsuccessful Synthetic Approach to 1-Alkyl-2-aryltetrahydro-
isoquinolines 52

3.2.5 Summary of Synthesized Test-Compounds with a
Tetrahydroisoquinoline Scaffold 53
3.3 Pharmacological Characterization of the Tetrahydroisoquinolines 54
3.3.1 54Binding to Human Estrogen Receptors (ERα and ERβ)
3.3.2 Functional Characterization of the THIQs in the Luciferase
Assay 58

3.3.3 Antiproliferative Activity 62
3.4 Separation and Characterization of Enantiomeric Tetrahydroiso-
quinolines 68

3.4.1 Separation of the Enantiomers 69
3.4.2 71Binding Affinities of the Enantiomers to ERα and ERβ

4 74Binding Affinities of 2-Phenylindoles to ERα and ERβ
5 Conclusion 77
6 Experimental 79
6.1 Chemistry 79
6.1.1 Materials and General Methods 79
6.1.2 Chemical Methods and Analytical Data 81 VII
6.1.2.1 Synhesis of 2-Arylbenzofurans 81
6.1.2.2 Synthesis of 2-Aryltetrahydroisoquinolin-6-ols 101
6.1.2.3 of N-Trifluoroacetyl- and N-
Phenylsulfonyltetrahydroisoquinolin-6-ols 135

6.1.2.4 Unsuccessful Approach to 1-Alkyl-2-aryl-tetrahydro-
isoquinolines 147

6.1.2.5 Semipreparative Separation of Selected
Tetrahydroisoquinolines by Chiral HPLC 149

6.2 Pharmacology 150
6.2.1 Radiometric Binding Assay 150
6.2.2 Luciferase Assay 153
6.2.3 Determination of Antiproliferative Activity 155
7 References 157

D Expression, Function and Cross-Talk of Estrogen and
NPY Y Receptors in Human Breast Cancer Cells 161 1

1 Introduction 161
2 Results and Discussion 162
2.1 Characterization of Breast Cancer Cells with Respect to
Antriestrogen Sensitivity, ER, and NPY Y R Expression 1621
2.2 Effect of (Anti)estrogens on Y R Expression in Human Breast 1
Cancer Cells 168
2.2.1 Characterization of the Estrogen-Induced Y R Up-regulation 1
at the Protein Level 169
2.2.2 Concentration De