Functional characterisation of the centrosomal protein Cep170 [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Stefan Lamla

Stefan Lamla

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• Biologie

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• Publié par: ludwig-maximilians-universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 23
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 3 Mo

Extrait

Functional Characterisation of the
Centrosomal Protein Cep170




Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften
der Fakultät für Biologie der Ludwig-Maximilians-Universität
München





Vorgelegt von
Stefan Lamla
München, 2008




















Dissertation eingereicht am:
03. November 2008

Tag der mündlichen Prüfung:
22. Januar 2009

Erstgutachter: Prof. E.A. Nigg
Zweitgutachter: PD Dr. A. Böttger


Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig und ohne unerlaubte
Hilfe angefertigt habe. Sämtliche Experimente wurden von mir selbst durchgeführt, soweit
nicht explizit auf Dritte verwiesen wird. Ich habe weder an anderer Stelle versucht eine
Dissertation oder Teile einer solchen einzureichen bzw. einer Prüfungskommission
vorzulegen, noch eine Doktorprüfung zu absolvieren.

München, den























1 ZUSAMMENFASSUNG.............................................................................................................. 1
2 SUMMARY.................................................................................................................................. 2
3 INTRODUCTION......................................................................................................................... 3
3.1 The centrosome.................................................................................................................................... 3
3.2 The centrosome cycle........................................................................................................................... 5
3.3 Function of the centrosome................................................................................................................. 9
3.4 Centrosomes, organisers of the MTs ................................................................................................ 10
3.5 Centrioles as templates for PC formation ....................................................................................... 12
3.6 The life cycle of the PC...................................................................................................................... 14
3.7 PC in signalling .................................................................................................................................. 20
3.8 Cep170 ................................................................................................................................................ 25
4 AIMS OF THIS PROJECT........................................................................................................ 26
5 RESULTS.................................................................................................................................. 27
5.1 Cep170 or Ninein depletion affect MT anchoring........................................................................... 27
5.2 The localisation of Cep170 is dependent on Ninein ........................................................................ 30
5.3 The C-terminal half of Cep170 interacts with Ninein .................................................................... 32
5.4 Expression of different Ninein fragments affect Cep170 localisation and MT anchoring .......... 35
5.5 The C-terminus of Cep170 bundles MT in vivo and in vitro ....................................................... 40
5.6 The MT binding domain of Cep170 ................................................................................................. 42
5.7 Cep170 depletion destabilises the MT network............................................................................... 44
5.8 Cdk1 regulates the localisation of Cep170....................................................................................... 46 5.9 Yeast two hybrid interactors of Cep170........................................................................................... 51
5.10 Bioinformatic characterisation of PRAX-1 and IFT81 .................................................................. 51
5.11 PRAX-1 and IFT81 localise to the mother centriole....................................................................... 52
5.12 The C-terminus of IFT81 determines localisation to the mother centriole .................................. 56
5.13 SH3(1) of PRAX-1 determines localisation to the mother centriole.............................................. 58
5.14 IFT81 in cell cycle.............................................................................................................................. 60
5.15 IFT81 is both an appendage protein and a ciliary protein............................................................. 61
5.16 IFT81 localisation to the centriole is dependent on Cep170........................................................... 63
5.17 IFT81 depletion inhibits ciliogenesis................................................................................................ 65
5.18 Cep170 depletion inhibits cilium resorption ................................................................................... 68
6 DISCUSSION............................................................................................................................ 70
6.1 Cep170, Ninein and the MTs............................................................................................................. 70
6.2 Cep170, PRAX-1 and IFT81............................................................................................................. 73
7 MATERIAL AND METHODS .................................................................................................... 78
7.1 Chemicals, materials and antibodies................................................................................................ 78
7.2 Plasmid preparation.......................................................................................................................... 78
7.3 Recombinant protein......................................................................................................................... 79
7.4 Antibody production ......................................................................................................................... 80
7.5 Cell culture and transfection ............................................................................................................ 80
7.6 SiRNA experiments ........................................................................................................................... 81
7.7 Immunofluorescence microscopy and immunoblotting ................................................................. 81
7.8 Immunoprecipitation and Pull down assays.................................................................................... 82 7.9 MT regrowth assays and depolymerization assays......................................................................... 82
7.10 Yeast two hybrid experiments .......................................................................................................... 83
7.11 Cdk1 kinase assays ............................................................................................................................ 83
7.12 Cdc14a phosphatase assay ................................................................................................................ 84
7.13 MT bundling assays........................................................................................................................... 84
7.14 PC growth and resorption assays ..................................................................................................... 84
8 ABBREVIATIONS..................................................................................................................... 93
9 ACKNOWLEDGEMENTS......................................................................................................... 95
10 REFERENCES ...................................................................................................................... 96
CURRICULUM VITAE.....................................................................................................................115
Zusammenfassung
1 Zusammenfassung
Zentrosomen erfüllen zwei Funktionen: 1) Sie organisieren die Mikrotubuli (MT) und 2)
sie stellen eine Vorlage für den Bau primärer Zilien (PZ) zu Verfügung. Zentrosomen be-
stehen aus zwei Zentriolen, der Mutter- und Tochterzentriole. Die Mutterzentriole ist durch
subdistale und distale Anhängsel charakterisiert, die für die Erfüllung beider Funktionen
benötigt werden.
Die Verankerung der MT wird von dem subdistalen Anhängselprotein Ninein vermittelt. Es
war jedoch unbekannt, ob Ninein alleine oder im Verbund mit anderen Proteinen zusam-
men wirkt. Hier konnten wir zeigen, dass Ninein mit Cep170 interagiert, und dass Cep170
an