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Caractérisation de la diversité microbienne aeroportée des biogazAuteur : Marina MOLETTADirecteur de thèse : Jean-Jacques GODONLaboratoire de biotechnologie de l’environnement, INRA, Narbonne« Fil d’Ariane » entre tous les écosystèmes, l’air est certainement Dans cette étude, la microflore aéroportée des biogaz a étéle meilleur vecteur de dissémination pour les micro-organismes caractérisée de manière quantitative (comptage en microscopie,3et, avec 14 m d’air inspiré par jour pour l’homme, une source PCR quantitative en temps réel) et qualitative (empreintesde contact microbien non négligeable. Un certain nombre de moléculaires et inventaires).sources naturelles ou anthropiques ont été identifiées, dispersantdes aérosols microbiens par l’air et plus largement les gaz. I MéthodologieDans le contexte actuel de l’augmentation de la production dedéchets, la digestion anaérobie et la valorisation du biogaz ainsi Les sites de prélèvements de cette étude ont été choisis enproduit apparaissent comme des solutions d’avenir pour leur fonction de 3 critères : le type de déchets traités, le type detraitement. La valorisation du biogaz est au centre d’un double procédé réalisant la digestion anaérobie et la température deenjeu : augmenter la part des énergies « vertes » dans la fonctionnement. 5 sites de différentes localisations ont étéconsommation énergétique et limiter l’impact du biogaz sur choisis selon ces critères. La flore totale du biogaz a été ...

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DÉCHETS - REVUE FRANCOPHONE D’ÉCOLOGIE INDUSTRIELLE - CAHIER SPÉCIAL DU NUMÉRO 44 - DÉCEMBRE 2006 - REPRODUCTION
INTERDITE
« Fil d’Ariane » entre tous les écosystèmes,l’air est certainement
le meilleur vecteur de dissémination pour les micro-organismes
et, avec 14 m
3
d’air inspiré par jour pour l’homme, une source
de contact microbien non négligeable. Un certain nombre de
sources naturelles ou anthropiques ont été identifiées,dispersant
des aérosols microbiens par l’air et plus largement les gaz.
Dans le contexte actuel de l’augmentation de la production de
déchets, la digestion anaérobie et la valorisation du biogaz ainsi
produit apparaissent comme des solutions d’avenir pour leur
traitement. La valorisation du biogaz est au centre d’un double
enjeu : augmenter la part des énergies « vertes » dans la
consommation énergétique et limiter l’impact du biogaz sur
l’effet de serre. Son mode de production biologique et son
éventuelle injection dans le réseau de gaz narurel pose la
question de sa composition microbiologique. Plusieurs risques
peuvent être évoqués tels que l’altération du réseau par des
phénomènes de biocorrosion, des fuites dans le réseau sur les
lieux de production ou d’utilisation pouvant conduire à une
exposition des personnes à ces aérosols microbiens. Dans le
but de connaître la composition microbiologique du biogaz,
l’ADEME et Gaz de France se sont associés dans un programme
de recherche dans lequel s’inscrit ce travail.Cette étude est une
approche préliminaire et n’a pas pour objectifs d’évaluer le
risque microbiologique sanitaire et corrosif lié au biogaz. Le but
est de faire un état des lieux qualitatifs et quantitatifs de la
microflore transportée par les biogaz ;ceci permettant d’orienter
de futures recherches.
Cette question a été étudiée dans ce travail à partir de
6 biogaz issus de 5 sites de productions différents à l’aide des
outils moléculaires permettant de s’affranchir des biais liés à la
cultivabilité des micro-organismes.
Dans cette étude, la microflore aéroportée des biogaz a été
caractérisée de manière quantitative (comptage en microscopie,
PCR quantitative en temps réel) et qualitative (empreintes
moléculaires et inventaires).
I Méthodologie
Les sites de prélèvements de cette étude ont été choisis en
fonction de 3 critères : le type de déchets traités, le type de
procédé réalisant la digestion anaérobie et la température de
fonctionnement. 5 sites de différentes localisations ont été
choisis selon ces critères.La flore totale du biogaz a été observée
et comptée par microscopie à épifluorescence (DAPI). Le
protocole d’extraction des acides nucléiques des aérosols
microbiens est donné par Moletta et al. (2005). La totalité de
l'ADNr 16S et 18S est amplifiée à l'aide des amorces universelles
Bactérie,Archées et Eucaryotes sont amplifiées. L’utilisation de
la PCR nichée a permis de réaliser les analyses SSCP (
Single Stand
Conformation Polymorphism
) et
les inventaires moléculaires.
Ces résultats de description de la diversité microbienne
aéroportée des biogaz ont permis de définir 5
groupes
microbiens, choisis comme témoins de l’aérosolisation
différentielle. Ces groupes sont Bactéries,Archées, Synergistes,
Staphylococcus spp
. et
Propionibacterium acnes
. Ils ont été
quantifiés par PCRq dans le biogaz et dans sa source,le digesteur
anaérobie pour les 6 matrices issue des biogaz et les 4 matrices
issues du contenu du digesteur anaérobie.
II Les Résultats
II.1) La description diversité microbienne aéroportée des
biogaz
La diversité microbienne transportée par les biogaz a été
décrite quantitativement et qualitativement.
Caractérisation de la diversité microbienne
aeroportée des biogaz
Auteur : Marina MOLETTA
Directeur de thèse : Jean-Jacques GODON
Laboratoire de biotechnologie de l’environnement, INRA, Narbonne
Les résultats des comptages en microscopie à épifluorescence
montrent qu’elle est caractérisée par une quantité de cellules
relativement constante autour 106 cellules procaryotes/m
3
et
104 cellules eucaryotes/m
3
. L’analyse globale de la diversité par
SSCP montre que les diversités microbiennes des biogaz sont
qualitativement différentes et différent également du contenu
du digesteur.La microflore Bactérie en aérosol est plus complexe
que celles des Eucaryotes. L’identification des espèces Bactérie
et Eucaryote présentes dans le biogaz confirme les différences
observées par empreintes moléculaires au sein des diversités
des biogaz et montre qu’il n’y a pas, en terme de diversité
microbienne, « un biogaz » mais « des biogaz ». Cependant,
cette diversité présente des points communs à la fois au niveau
des phyla, des sous-groupes et des espèces retrouvés dans les
différents biogaz. Les résultats des inventaires moléculaires
montrent une grande diversité des espèces présentes dans
les biogaz (Figure 1). Pour le domaine Bactérie, 499 séquences
d’ARNr 16S ont été réalisées se regroupant en 183 espèces.
Parmi les espèces en aérosols dans le biogaz, une proportion
de 44 % de l’abondance représente une diversité bactérienne
inconnue.Les diversités bactériennes des biogaz sont différentes
en termes d’espèces présentes. Cependant, elles présentent
certaines concordances aux niveaux des phyla. De manière
générale, la diversité totale des biogaz décrite à partir des
6 échantillons de biogaz analysés est dominée par le
phylum
Firmicutes
avec
Clostridium spp
. et
Bacillus spp
. comme sous-
groupes dominants. Les 5 classes de Protéobactéries sont
retrouvées avec une dominance des
Alphaproteobacteria
et
des
Gammaproteobacteria
, représentant 14 % et 12 % de
l’abondance. Elles sont dominées par
Acetobacter spp.
,
Sphingomonas spp.
, et
Psychrobacter spp.
. Les Bactéroidetes
représentent 13 % de l’abondance totale et sont dominés par
les sous-groupes
Prevotella spp
. et
Rickenella spp
.
Dans le cas de la diversité des Eucaryotes, 177 séquences
d’ADNr 18S ont été réalisées dont 87 appartiennent au règne
des champignons et des levures. Certains groupes ont été
retrouvés dans plusieurs biogaz :
Cladosporium sp., Hortea
werneckii,Trichosporon sp.,
et
Aspergillus terreu
s, qui est l’espèce
la plus abondante (15 % de l’abondance).
Figure 1 : Groupes bactériens retrouvés dans la diversité bactérienne des biogaz.
Seuls les groupes supérieurs à 3 % d’abondance sont représentés. Les groupes
Deltaproteobacteria et Epsilonproteobacteria, Chlamydia/Planctomyces,
Synergistes,
Cyanobacteria,
Deinococcus/Thermus,
Acidobacteria,
Gemmatimonadetes et Fusobacteria
ainsi que les groupes n’ayant pas de
représentant cultivé OP05,WS06 et WS01 ne sont pas représentés.
II.3. L’aérosolisation différentielle : son observation dans
le biogaz
La comparaison des empreintes moléculaires Bactérie et
Eucaryote des biogaz et de leur source montre que la diversité
microbienne transportée par le biogaz n’est pas une copie de
la communauté microbienne de sa source. Cette observation
est confirmée par les données des inventaires moléculaires.
En effet, des disparités importantes sont observées entre les
proportions des différents groupes microbiens au niveau du
phylum et du phylotype entre le biogaz et son digesteur
anaérobie source.
Des comportements d’aérosolisation différents semblent être
la cause principale de ces disparités entre les deux diversités
microbiennes.
Ainsi, trois comportements ont été mis en évidence dans le
biogaz (Figure 2) :
• L’aérosolisation active : elle caractérise les micro-organismes
préférentiellement aérosolisés. L’aérosolisation active a été
montrée quantitativement pour
Staphylococcus spp.
et
Propionibacterium acnes
.
• La non-aérosolisation active : elle caractérise les micro-
organismes non-préférentiellement aérosolisés. La non-
aérosolisation active a été montrée quantitativement pour les
Archées et les Synergistes.
• L’aérosolisation passive : elle est mise en évidence par la
détection dans le biogaz de micro-organismes non-
préférentiellement aérosolisés. La présence dans le biogaz de
ces micro-organismes montre qu’en supplément des deux
comportements « actifs », il existe une aérosolisation passive,
probablement essentiellement tributaire de phénomènes
physiques conduisant n’importe lequel des groupes microbiens
du milieu source à se retrouver en aérosol.
Figure 2 : Comparaison des taux d’aérosolisation de chaque groupe. Les “boîtes à
moustaches” représentent la distribution schématique des valeurs du rapport
(Proportion du groupe dans le biogaz/proportion du groupe dans le digesteur) des
différents groupes choisis comme témoins d’aérosolisation différentielle. La validité
de la distribution a été évaluée par le calcul du coefficient de Spearman (0,88).
III Conclusions
Ce travail a permis de caractériser une diversité microbienne
jusqu’alors inconnue.Le biogaz apparaît être un vecteur pouvant
transporter n’importe laquelle des espèces composant l’énorme
diversité de sa source, provenant soit des déchets soit de la
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DÉCHETS - REVUE FRANCOPHONE D’ÉCOLOGIE INDUSTRIELLE - CAHIER SPÉCIAL DU NUMÉRO 44 - DÉCEMBRE 2006 - REPRODUCTION INTERDITE
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communauté microbienne de la digestion anaérobie.Cependant,
la diversité microbienne de l’air que nous respirons ainsi que
celle du gaz naturel ne sont pas à ce jour que très peu
documentées.Il est donc impossible d’évaluer les conséquences
sanitaires et corrosives de l’addition de cette microflore du
biogaz à la diversité microbienne déjà présente dans l’un ou
l’autre de ces deux environnements.
Cette étude est un point de départ pour de futures recherches
qui permettront de donner de plus amples informations sur
cette diversité microbienne en termes de dynamique spatiale
(de la production à l’injection) et temporelle.
DÉCHETS - REVUE FRANCOPHONE D’ÉCOLOGIE INDUSTRIELLE - CAHIER SPÉCIAL DU NUMÉRO 44 - DÉCEMBRE 2006 - REPRODUCTION INTERDITE