Desarrollo de un protocolo de análisis de la expresión génica mediante «differential display» que reduce el número de falsos positivos. (The development of a protocol for the analysis of genetic expression through «differential display», as a means to reducing the number of false positives.)

Vieites Jm

Description

Resumen
Entre los métodos empleados para los análisis de la expresión de genes, el método de "differential display" ha sido ampliamente utilizado y, a pesar del uso extendido de los "microarrays", es aún un método válido para el análisis con muestras cuyo transcriptoma es desconocido. Con el objeto de reducir el elevado número de falsos positivos que genera esta técnica, hemos optimizado el protocolo para reducir la posibilidad de generar falsos positivos. En primer lugar, hemos marcado radiactivamente el cebador oligo-dT con lo que los fragmentos de DNA identificados son extremos 3'-UTR de RNAm. Por muestra hemos realizado dos transcripciones inversas y dos reacciones de PCR en cada una de ellas. Para seleccionar un fragmento de DNA, debía estar diferencialmente expresado en las 4 reacciones de PCR. Por último, todos los fragmentos fueron clonados y secuenciados por triplicado. Estas modificaciones al protocolo nos ha permitido identificar 5 genes expresados diferencialmente entre células epiteliales de intestino en estado proliferativo y diferenciado.
Abstract
The analysis of genetic expression, the differential display (DD) method has been widely used, but in spite of the extensive use of the «microarrays» method, it is still to be considered as a valid method for the analysis of samples whose transcriptone is not known. In this work, an attempt has been made to reduce the high number of false positives generated by this technique by optimising method protocol. As a preliminary step, we radioactively marked the oligo dT primer with which the fragments of identified DNA were extreme 3'-UTR of mRNA. For each sample two inverse transcriptions and two PCR reactions were performed. Only fragments of DNA that are expressed differentially in all 4 PCR reactions should be selected. Finally, all of the fragments were cloned and sequenced in triplicate. These protocol modifications have allowed us to identify 5 differentially expressed genes, in intestinal epithelial cells in both proliferative and differentiated states.

Sujets

• Diferenciación
• Différentiation
• Enterocyte

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• Publié par: erevistas
• Publié le: 01 janvier 2005
• Nombre de lectures: 18
• Langue: Español

Extrait

DESARROLLO DE UN PROTOCOLO DE ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA MEDIANTE «DIFFERENTIAL DISPLAY»... 193
THE DEVELOPMENT OF A PROTOCOL FOR THE ANALYSIS OF GENETIC EXPRESSION THROUGH «DIFFERENTIAL DISPLAY»...
Desarrollo de un protocolo de análisis
de la expresión génica mediante «differential
display» que reduce el número
de falsos positivos
The development of a protocol for the analysis of genetic
expression through «differential display», as a means to reducing
the number of false positives
VIEITES JM, SÁNCHEZ-POZO A, GIL A Y SUÁREZ A
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Farmacia. Universidad de Granada
Granada, 18071. Tlf: 958243838 Fax: [phone]
RESUMEN
Entre los métodos empleados para los análisis de la expresión de genes, el método de "differential
display" ha sido ampliamente utilizado y, a pesar del uso extendido de los "microarrays", es aún un
método válido para el análisis con muestras cuyo transcriptoma es desconocido. Con el objeto de reducir
el elevado número de falsos positivos que genera esta técnica, hemos optimizado el protocolo para
reducir la posibilidad de generar falsos positivos. En primer lugar, hemos marcado radiactivamente el
cebador oligo-dT con lo que los fragmentos de DNA identificados son extremos 3'-UTR de RNAm. Por
muestra hemos realizado dos transcripciones inversas y dos reacciones de PCR en cada una de ellas. Para
seleccionar un fragmento de DNA, debía estar diferencialmente expresado en las 4 reacciones de PCR.
Por último, todos los fragmentos fueron clonados y secuenciados por triplicado. Estas modificaciones
al protocolo nos ha permitido identificar 5 genes expresados diferencialmente entre células epiteliales
de intestino en estado proliferativo y diferenciado.
PALABRAS CLAVE: Diferenciación. Enterocitos. Análisis de expresión génica.
ABSTRACT
The analysis of genetic expression, the differential display (DD) method has been widely used, but in
spite of the extensive use of the «microarrays» method, it is still to be considered as a valid method
for the analysis of samples whose transcriptone is not known. In this work, an attempt has been made
to reduce the high number of false positives generated by this technique by optimising method protocol.
As a preliminary step, we radioactively marked the oligo dT primer with which the fragments of
identified DNA were extreme 3'-UTR of mRNA. For each sample two inverse transcriptions and two
PCR reactions were performed. Only fragments of DNA that are expressed differentially in all 4 PCR
reactions should be selected. Finally, all of the fragments were cloned and sequenced in triplicate. These
protocol modifications have allowed us to identify 5 differentially expressed genes, in intestinal epithelial
cells in both proliferative and differentiated states.
KEY WORDS: Differentiation. Enterocytes. Gene expression analysis.
Ars Pharm 2005; 46 (2): 193-204.VIEITES JM, SÁNCHEZ-POZO A, GIL A, SUÁREZ A194
INTRODUCCIÓN INTRODUCTION
Uno de los mayores misterios de la vida One of the greatest mysteries of life from
desde un punto de vista fisiológico consiste en a physiological point of view is to know how
conocer cómo 25.000 genes integrados en nuestro the 25,000 genes integrated within our Geno-
Genoma son expresados de forma regulada y me are expressed in a regulated and coordi-
coordinada en el plano temporal y espacial para nated way in terms of time and space, in or-
dar lugar a los diferentes tejidos y órganos, en der to give rise to the growth of different tissues
suma, a la vida. La enfermedad o su desarrollo and organs, or in other words, to life itself.
genera en numerosos casos cambios drásticos Diseases or their development generate nume-
en la expresión de genes de las células en di- rous cases of dramatic changes in the expres-
ferentes tejidos y órganos. En la actualidad, sion of genes in the cells of different tissues
numerosos grupos de investigación y empre- and organs. Today, numerous research groups
sas estudian activamente las alteraciones en la and private companies are actively studying
expresión de genes producidas por distintas the alterations in gene expressions produced
enfermedades, con la intención de identificar by varying illnesses, as a means to identifying
dianas terapéuticas o de establecer perfiles de therapeutic targets, or to establishing expres-
expresión asociados a resistencias farmacoló- sion profiles associated with pharmacological
gicas, a la posibilidad de metástasis en los tu- resistence, to assessing the posibility of metas-
mores o a predicciones de la evolución de las tasis of tumours, or to predicting the evolution
enfermedades (Nature visión genoma). of diseases (Genome vision, Nature).
La metodología experimental empleada para The experimental methodology used to stu-
estudiar los cambios en la expresión de los dy changes in gene expressions has evolved
genes ha evolucionado mucho en los últimos a great deal during recent years: subtractive
2-4 2-4 5-años: la hibridación sustractiva , la expre- hybridisation , differential gene display (DD)
5-7 7 8,9sión diferencial de genes (DD) , el análisis , serial analysis of gene expression (SAGE) ,
8,9seriado de la expresión génica (SAGE) y, and finally those of DNA «microarrays» and
10,11por último, los "microarrays" y "macroarrays" «macroarrays» . The last two of these are
10,11de DNA . Son éstos últimos los mas em- the most currently used, because the method
pleados actualmente por su simplicidad de is easily manipulated, the results are reprodu-
manipulación, reproducibilidad de resultados cible and the quantity and quality of the bio-
y la cantidad y calidad de la información bio- logical information obtained is high.
lógica obtenida. The method for analysing differential gene
En concreto, el método de análisis de la expression through PCR with random primers
5 12-expresión diferencial de genes mediante PCR (DD) was described by Liang and Pardee ,
14con cebadores al azar (DD) fue descrita por . The technique proved to be appropriate and
5,12-14Liang and Pardee . La técnica mostró ser straightforward to handle, versatile, given that
una técnica simple en cuanto a manejo y it may be applied to small samples of any
aptitudes, versátil, pues se puede aplicar a origin, and efficient, given that changes in the
pequeñas muestras de cualquier origen y, efi- expression can be evaluated directly at the
caz, ya que los cambios en la expresión se first stage, that is, during polyacrylamide gel
pueden evaluar directamente en el primer paso, analysis. This technique is currently used in
el gel de poliacrilamida. Esta técnica se em- gene expression studies in samples, whose
plea actualmente en los estudios de expresión genome is unknown and therefore, cannot be
de genes en muestras cuyo genoma no es analysed through microarray analysis. Howe-
conocido y, por lo tanto, no puede analizarse ver, the method also presents some disadvan-
mediante "microarrays". No obstante, presen- tages: the high number of analyses required
ta varias inconvenientes experimentales: el to be able to study the total changes in the
elevado número de análisis necesarios para gene expression of a sample, and the high
15,16estudiar los cambios totales en la expresión number of false positives .
de genes de una muestra y la cantidad eleva- In this work, our research group has pro-
15,16da de falsos positivos . vided a series of solutions to the problems
Ars Pharm 2005; 46 (2): 193-204.DESARROLLO DE UN PROTOCOLO DE ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA MEDIANTE «DIFFERENTIAL DISPLAY»... 195
THE DEVELOPMENT OF A PROTOCOL FOR THE ANALYSIS OF GENETIC EXPRESSION THROUGH «DIFFERENTIAL DISPLAY»...
El presente trabajo recoge una serie de presented by this method, which on applica-
soluciones aportadas por nuestro grupo, que tion result in a lower number of false positi-
aplicadas a la técnica, permiten reducir el ves and an improvement in efficiency, which
número de falsos positivos y aumentar su dramatically reduces the subsequent work in-
efectividad que reduce drásticamente el traba- volved in the validation of the results obtai-
jo de validación posterior de los resultados ned.
obtenidos.
MATERIALS AND METHODS
MATERIALES Y MÉTODOS
Biological material and experimental design
Material biológico y diseño experimental
Intestinal epithelial cells from rat embryo,
Se usaron células epiteliales de intestino IEC-6, provided by American Type Culture
embrionario de rata IEC-6, proporcionadas por Collection (ATCC-CRL 1592), were cultured
2 2 la American Type Culture Collection (ATCC- in plastic jars of 25 cm or 75 cm , and on
2trays of six dishes of approximately 10 cm inCRL 1592), que se cultivaron en frascos de
1/4plástico de 25 cm2 o de 75 cm2 y en placas surface area, in an incubator at 37 C, 5%
de 6 pocillos de aproximadamente 10 cm2 de CO and 95% relative humidity. Culture