DETECCIÓN DE VARIABILIDAD EN RAZAS CANINAS AUTÓCTONAS ESPAÑOLAS MEDIANTE MARCADORES RAPD(VARIABILITY IN SPANISH DOG BREED DETECTED BY RAPD MARKERS)

L.

Description

Resumen
Se describe la variabilidad de razas caninas autóctonas españolas estudiada con marcadores RAPD previamente descritos para la detección de polimorfismo en razas caninas Galgo Español, Podenco, Perro de Agua (PAE) y Alanos, mostraron diferencias en el número y tamaño de las bandas amplificadas. Las mayores diferencias se obtuvieron al utilizar la pareja de iniciadores RAPD1+2, que detectan 4 bandas en Alanos (tamaños aproximados de 400, 500, 700 y 850 pb), 2 en PAE (»400 pb y »500 pb) y solamente una (»400 pb) en Galgos y Podencos.
Abstract
We described the results obtained in a study in four dog Spanish breeds with RAPD markers, previously described as useful in detecting variability in dog populations. We have detected differences among breeds both in the number and size of amplified bands. The larger differences were detected using the pair of primers RAPD1+2, which detected 4 bands in Alanos, 2 in Perro de Agua and only one in Podenco and Galgo.

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• Molecular marker

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• Publié le: 01 janvier 2001
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Extrait

NOTA BREVE
DETECCIÓN DE VARIABILIDAD EN RAZAS CANINAS
AUTÓCTONAS ESPAÑOLAS MEDIANTE MARCADORES RAPD
VARIABILITY IN SPANISH DOG BREED DETECTED BY RAPD MARKERS
Morera Sanz, L., C.J. Barba Capote y J.J. Garrido Pavón
Unidad Mixta CSIC UCO (Marcadores genéticos moleculares). Departamento de Genética. Facultad de
Veterinaria. Avda. Medina Azahara nº 9. 14005 Córdoba. España.
PALABRAS CLAVE ADICIONALES ADDITIONAL KEYWORDS
Marcadores moleculares. Molecular markers.
INTRODUCCIÓNRESUMEN
Se describe la variabilidad de razas caninas La amplificación de fragmentos de
autóctonas españolas estudiada con marcado ADN mediante la PCR, utilizando
res RAPD previamente descritos para la detec como iniciadores oligonucleótidos
ción de polimorfismo en razas caninas Galgo cortos (10 15 bases) de secuencia
Español, Podenco, Perro de Agua (PAE) y Ala aleatoria, es una técnica para detectar
nos, mostraron diferencias en el número y tama polimorfismo genético. Desarrollada
ño de las bandas amplificadas. Las mayores por Welsh y McClelland (1990) y co
diferencias se obtuvieron al utilizar la pareja de nocida como RAPD ( random ampli
iniciadores RAPD1+2, que detectan 4 bandas en fication of polymorphic DNA ), se basa
Alanos (tamaños aproximados de 400, 500, 700
en la utilización de condiciones poco
y 850 pb), 2 en PAE (»400 pb y »500 pb) y
restrictivas, en la etapa de unión de los
solamente una ( »400 pb) en Galgos y Podencos.
iniciadores al ADN. Todas aquellas
regiones del ADN en las cuales se
produzca la unión de estos iniciadores
SUMMARY
en lugares suficientemente próximos y
situados en cadenas opuestas, resulta
We described the results obtained in a study
rán amplificadas. El resultado es lain four dog Spanish breeds with RAPD markers,
obtención de un conjunto de fragmen previously described as useful in detecting
tos amplificados, cuyo número y ta variability in dog populations. We have detected
maño (pb) son característicos del ini differences among breeds both in the number and
ciador y del ADN molde utilizados. Elsize of amplified bands. The larger differences
polimorfismo (diferencias en el patrónwere detected using the pair of primers RAPD1+2,
which detected 4 bands in Alanos, 2 in Perro de de bandas) se produce por la existen
Agua and only one in Podenco and Galgo. cia de diferencias entre individuos en
Arch. Zootec. 50: 379 382. 2001.MORERA SANZ, BARBA CAPOTE Y GARRIDO PAVÓN
la secuencia de bases del lugar de unión zas Galgo español, Podenco Andaluz,
de los iniciadores, causadas por muta Perro de Agua Español (PAE) y Ala
ciones puntuales o estructurales, que nos, localizados en diferentes lugares
permiten la unión en unos individuos de su zona de distribución. Se utiliza
pero no en otros. ron seis marcadores RAPD previamen
Las ventajas de esta técnica sobre te descritos como útiles para la detec
otras utilizadas para la detección de ción de polimorfismo en razas caninas
variabilidad genética, han favorecido (Rothuizen y van Wolferen 1993).
su aplicación tanto en humanos como
en perro (Rothuizen y van Wolferen DETECCIÓN
1993; Olivier et al., 1999), vacuno Veinte ng de ADN, obtenidos a
(Gwakisa et al ., 1994), caballo (Bailey partir de sangre fresca, o 5 ml de una
y Lear 1994) y ovino (Kantanen et al ., dilución 1/20 de linfocitos congelados
1995), en los que se ha utilizado para la y descongelados, fueron amplificados
caracterización de razas, marcadores
específicos de raza o la detección de
enfermedades genéticas. Tabla I. Marcadores RAPD para los que se
En este trabajo presentamos los re detectaron diferencias entre las razas (ban
sultados de un estudio para evaluar la das específicas) a partir de los análisis de
utilidad de la técnica RAPD para de mezclas de muestras. (RAPD markers for which
tectar polimorfismo genético en po breed differences were detected).
blaciones caninas autóctonas españo
las. Para la amplificación hemos utili Tamaño de las bandas (pb)
zado, mezclas de muestras de ADN,
RAPD5 280 680 720 1020así como muestras individuales. La
Galgos + + - -amplificación de una mezcla de mues
PAE + + - -tras de ADN, ha sido utilizada en di
Alanos + + + +
versos trabajos (Gwakisa et al., 1994;
RAPD1+2 400 500 700 850
Bailey y Lear 1994) y permite evaluar
Galgos + - - -
de forma rápida la capacidad de un
Podencos + - - -
gran número de iniciadores para de PAE + + - -
tectar polimorfismos específicos de Alanos + + + +
razas o poblaciones. La amplificación RAPD1+4 210 280 400 450 500 620
de muestras individuales permite esti Galgos + + + + - +
Podencos + + + + - +mar, mediante la comparación de los
PAE + + + + + +patrones de bandas obtenidos en cada
Alanos + + + - - +caso, la variabilidad genética entre ra
RAPD3+4 400 500 950 2000zas y dentro de razas.
Galgos + + + +
PAE + - + -
Alanos + - + -
MATERIAL Y MÉTODOS
+/ : presencia / ausencia de la banda correspon
RAZAS Y MARCADORES
diente; PAE: perro de agua español.
Se estudiaron individuos de las ra
Archivos de zootecnia vol. 50, núm. 191, p. 380.MARCADORES RAPD EN RAZAS CANINAS ESPAÑOLAS
de bandas de los individuos X e Y. El
Tabla II. Número de bandas (número me
valor medio del indíce de similitud se
dio entre paréntesis) y rango de tamaños
calculó por S = ? S/n, siendo S el
i i(pb) observados para los marcadores RAPD
valor del índice para el par i y n el
en los que no se detectaron bandas especí
número de comparaciones efectuadas.
ficas de raza, pero sí diferencias entre indi
El error típico del índice de similitud
viduos. (Average number and range sizes of
se obtuvo mediante la expresión S.E.:
bands for markers with no breed specific bands
2S(1 – S)(2 – S)/N(4 – S), en la que N
but with individual differences).
es el número medio de fragmentos.
Número de Rango de
bandas (media) tamaños (pb)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
RAPD2 5 9 (7,5) 280 1000
El rango de tamaños de las bandas
RAPD4 6 8 (7) 240 850
observadas para el conjunto de los
RAPD1+4 4 7 (6,5) 200 600
RAPDs fue de 160 2000 pb, algo dife
RAPD4+5 8 10 (9) 160 2000
rente del obtenido (100 1500 pb) con
estos marcadores (Rothuizen y van
Wolferen, 1993), en animales de 16
razas no españolas (1 animal/raza).
por PCR (5 min a 95º, seguidos de 35Esto indica que hemos amplificado
ciclos de 94º, 1min fi 35º, 30 s fi 72º, bandas, ausentes en estas razas no es
1 min). Para la amplificación se usaron pañolas. Para cuatro marcadores RAPD
125 mM de desoxinucleótidos, 2,5 mM o combinaciones de ellos, se han regis
MgCl , 1 mM de iniciador y 0,5 U de trado posibles bandas específicas: pre
2
polimerasa Taq, en un volumen final sentes en una raza y ausentes en las
de 25 ml. Se analizaron, para cada raza,otras (tabla I). La supuesta banda es
muestras individuales y mezclas, he pecífica se mostró en cada uno de los
chas añadiendo cantidades iguales de 10 animales utilizados para hacer la
ADN o linfocitos de 10 animales de la mezcla, estando ausente en los demás.
misma raza. 15 ml del producto PCR, Las mayores diferencias entre razas se
mezclado con 3 ml de azul de bromo obtuvieron utilizando los marcadores
fenol (0,25 p.100), se sometieron a 1 y 2 simultáneamente, (RAPD1+2):
electroforesis en agarosa 2 p.100, en en este caso se observaron 4 bandas en
tampón TBE 0,5x, durante 1 hora a Alanos ( » 400, 500, 700 y 850 pb), 2 en
100 V. El revelado se hizo con Bromuro PAE (» 400 y » 500 pb) y una ( » 400
de etidio (0,5 mg/ml). pb) en Galgos y Podencos.
Para otros cuatro marcadores RAPD
ANÁLISIS ESTADÍSTICO o combinación de ellos, aunque no se
El índice de similitud del patrón de detectaron bandas específicas de raza,
bandas se calculó según Lynch (1990),sí se obtuvieron patrones de bandas
como S = 2 N / (N + N ), siendo N que mostraron diferencias entre indi
XY X Y XY
el número de bandas comunes a los viduos, entre y dentro de razas (tabla
individuos A y B; N y N el número II). Para los marcadores en los que se
X Y
Archivos de zootecnia vol. 50, núm. 191, p. 381.MORERA SANZ, BARBA CAPOTE Y GARRIDO PAVÓN
Tabla III. Índices de similitud media para los marcadores RAPD2, RAPD4, RAPD1+4 y
RAPD4+5, entre y dentro de razas, obtenidos a partir de 15 comparaciones/marcador. Entre
paréntesis se indican los errores típicos. (Average similitud index for the markers studied).
Galgos Podencos PAE Alanos
Galgos 0,91 (0,13) 0,88 (0,09) 0,86 (0,12) 0,85 (0,07)
Podencos 0,87 (0,12) 0,87 (0,12) 0,83 (0,08)
PAE 0,93 (0,10) 0,88 (0,09)
Alanos 0,89 (0,18)
detectaron diferencias individuales Los resultados obtenidos indican
pero no bandas específicas de raza, el que la variabilidad genética